Клеточная культура

Окрашенная культура клеток эпителия. На фото кератин (красный) и ДНК (зеленая)

Культивирование клеток представляет собой процесс, посредством которого in vitro отдельные клетки (или единственная клетка) прокариот и эукариот искусственно выращиваются в контролируемых условиях. На практике термин «культура клеток» относится в основном к выращиванию клеток, относящихся к одной ткани, полученных от многоклеточных эукариот, чаще всего животных. Историческое развитие технологии и методик выращивания культур клеток неразрывно связаны с выращиванием тканевых культур и целых органов.

История

В XIX веке английский физиолог С. Рингер разработал солевой раствор^[1], содержащий хлориды натрия, калия, кальция и магния для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 году Вильгельм Ру установил принцип культивирования тканей, извлек часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физрастворе в течение нескольких дней^[2]. Росс Гранвилл Харрисон, работавший в Медицинской школе Дж. Хопкинса, а затем в Йельском университете, опубликовал результаты своих экспериментов в 1907 −1910 годах, создав методологию культивирования тканей. Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940-х 1950-х годах в связи с исследованиями в области вирусологии. Выращивание вирусов в культурах клеток дало возможность получения чистого вирусного материала для производства вакцин. Вакцина против полиомиелита стала одним из первых препаратов, массово произведенных с использованием технологии культивирования клеток.

Основные принципы культивирования

Выделение клеток

Для культивирования вне организма живые клетки могут быть получены несколькими способами. Клетки могут быть выделены из крови, но к росту в культуре способны только лейкоциты. Моноядерные клетки могут быть выделены из мягких тканей с помощью таких ферментов как коллагеназа, трипсин, проназа, разрушающих внеклеточный матрикс^[3]. Кроме того, в питательную среду можно поместить кусочки тканей. Клетки, взятые непосредственно от объекта, называются первичными^[4]. Большинство первичных клеток, за исключением опухолевых, имеют ограниченный срок использования. После определенного количества делений клетки подвергаются процессу старения и прекращают делиться, но жизнеспособность не утрачивают. Существуют «бессмертные» линии клеток, способные размножаться бесконечно. Эта способность является результатом случайной мутации, либо приобретена искусственно, с помощью подавления гена теломеразы^[5].

Выращивание клеток

Клетки выращивают в специальных питательных средах, при постоянной температуре и в специальной газовой среде в инкубаторе клеточных культур^[6][7]. Питательные среды для разных культур клеток различаются по составу, pH, концентрации глюкозы, составу факторов роста и др^[8]. Факторы роста, используемые в питательных средах, чаще всего получают из крови. Одним из факторов риска при этом является возможность заражения культуры клеток прионами или вирусами. При культивировании одной из важных задач является исключение или сведение к минимуму использование зараженных ингридиентов. Однако на практике это бывает достигнуто не всегда. Клетки можно выращивать в суспензии, либо в адгезивном состоянии. Некоторые клетки (такие, как клетки крови) в естественных условиях существуют во взвешенном состоянии. Существуют также линии клеток, искусственно измененных таким образом, чтобы они не могли прикрепляться к поверхности, это сделано для того, чтобы увеличить плотность клеток в культуре. Для выращивания адгезивных клеток требуется поверхность, например, культура ткани, или пластик, покрытый элементами внеклеточного матрикса для улучшения сцепных свойств, и для стимулирования роста и дифференцирования. Большинство клеток из мягких и твердых тканей адгезивны. Из адгезивного типа культуры выделяется органотипический тип культуры клеток, который представляет собой трехмерную среду, в отличие от от обычной лабораторной посуды. Этот система культивирования физически и биохимически наиболее схожа с живыми тканями, но имеет некоторые технические сложности в обслуживании (например, нуждается в диффузии).

Перекрестное загрязнение клеточных линий

При работе с клеточными культурами ученые могут столкнуться с проблемой перекрестного загрязнения. Судя по результатам исследований, можно предположить, что в 15-20 % случаев клетки, используемые в экспериментах были испорчены, или были загрязнены клетками других клеточных линий^[9].

Особенности выращивания клеток

При выращивании клеток, из-за постоянного деления может возникнуть их переизбыток в культуре. В результате чего могут возникнуть следующие проблемы:

• Накопление в питательной среде продуктов выделения, в том числе токсичных.
• Накопление в культуре омертвевших клеток, прекративших жизнедеятельность.
• Скопление большого количества клеток оказывает негативное влияние на клеточный цикл, рост и деление замедляются, а клетки начинают стареть и отмирать (контактное ингибирование роста).
• По той же причине может начаться клеточное дифференцирование.

Для поддержания нормального функционирования культур клеток а также для предотвращения негативных явлений периодически проводят замену питательной среды, пассажирование и трансфекция клеток. Во избежание загрязнения культур бактериями, дрожжами, или другими линиями клеток, все манипуляции обычно проводят с соблюдением правил асептики в стерильном боксе. Для подавления микрофлоры в питательную среду могут быть добавлены антибиотики (пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые препараты(амфотерицин Б).

Одним из продуктов метаболизма в клетках являются кислоты, вследствие чего pH среды постепенно снижается. Для контроля кислотности питательных сред, в них добавляют индикаторы pH. Если культура клеток адгезивная, питательную среду можно полностью заменять.

Пассажирование клеток

Пассажирование (разделение) клеток — это отбор небольшого количества клеток для выращивания в другом лабораторном сосуде. Культуру клеток можно использовать значительно дольше, если регулярно осуществлять отбор клеточного материала, что позволяет предотвратить преждевременное старение культуры вследствие повышения плотности заселения клеток. Суспензивные культуры пассажировать проще, так как для этого достаточно всего лишь отобрать необходимое количество клеток, поместить их в другие сосуды, и добавить свежей питательной среды. Адгезивные же клетки перед этим следует разделить. Чаще всего для этой цели используют смесь трипсина и ЭДТУ или другие ферментные смеси. Небольшое количество раздельных клеток может быть использовано для заселения новой культуры.

Трансфекция и трансдукция

Основная статья: Трансфекция

Основная статья: Трансдукция (генетика)

В клетки при их выращивании можно внедрять чужеродную ДНК путем трансфекции (невирусный метод). Часто данную технологию применяют для управляемой экспрессии генов. Сравнительно недавно для этих целей была успешно реализована трансфекция иРНК.

ДНК также может быть внедрена в геном клетки с помощью вирусов или бактериофагов. Они, являясь внутриклеточными паразитами, как нельзя лучше подходят для этих целей, так как внедрение генетического материала в клетку-хозяина является обычной частью их жизненного цикла^[10]. Этот метод называется трансдукция.

Линии клеток человека

Одна из самых ранних культур клеток человека, полученная от Генриетты Лакс, которая умерла от рака шейки матки. Культура клеток ядра окрашены в синий цвет.

Культивирование человеческих клеток несколько противоречит правилам биоэтики, поскольку изолированно выращиваемые клетки могут пережить родительский организм, а затем использоваться для проведения экспериментов или для разработки новых методов лечения и извлечения из этого прибыли. Первое судебное решение в данной области было вынесено в Верховном суде штата Калифорния по делу «Джон Мур против представителей Калифорнийского университета», согласно которому пациенты не имеют никаких прав собственности на линии клеток, полученных из органов, удаленных с их согласия^[11].

Линия клеток «Гибридома»

Основная статья: Гибридома

Линия клеток гибридома была получена в результате слияния нормальных клеток с «бессмертными». Используется для получения моноклональных антител. Лейкоциты, выделенные из селезенки или крови иммунизированных животных, скрещиваются с «бессмертной» линией клеток миеломы. Поскольку раковые клетки миеломы «бессмертны», то есть способны делиться большое количество раз, после скрещивания и соответствующей селекции гибридома, производящая моноклональные антитела против антигена, может поддерживаться долгое время.

Использование клеточных культур

Массовое культивирование клеток является основой для промышленного производства вирусных вакцин и разнообразных продуктов биотехнологии.

Продукты биотехнологии

Промышленным методом из культур клеток получают такие продукты, как ферменты, синтетические гормоны, моноклональные антитела, интерлейкины, лимфокины, противоопухолевые препараты. Хотя многие простые белки относительно просто могут быть получены с использованием рДНК в бактериальных культурах, более сложные белки, такие как гликопротеины, в настоящее время могут быть получены только из животных клеток. Одним из таких важнейших белков является гормон эритропоэтин. Стоимость выращивания культур клеток млекопитающих является довольно высокой, поэтому в настоящее время проводятся исследования по возможности производства сложных белков в культурах клеток насекомых или высших растений.

Тканевые культуры

Культивирование клеток является неотъемлемой частью технологии культивирования тканей и тканевой инженерии, поскольку именно оно определяет основы выращивания клеток и поддержания их в жизнеспособном состоянии ex vivo.

Вакцины

С применением методики культивирования клеток в настоящее время выпускаются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки. Вследствие угрозы пандемии гриппа, вызываемого , в настоящий момент правительство Соединенных Штатов финансирует исследования по получению вакцины против с использованием клеточных культур.

Культуры клеток не млекопитающих

Культуры клеток растений

Культуры клеток растений как правило выращиваются в виде суспензии в жидкой питательной среде, либо каллусной культуры на твердой питательной основе. Культивирование недифференцированных клеток и каллуса требует соблюдения определенного баланса гормонов роста растений ауксинов и цитокининов.

Бактериальные, дрожжевые культуры

Основная статья: Бактериальная культура

Для культивирования небольшого количества клеток бактерий и дрожжей клетки высеивают на твердую питательную среду на основе желатина или агар-агара. Для массового производства применяют выращивание в жидких питательных средах (бульонах).

Вирусные культуры

Культуры вирусов выращивают на культурах клеток млекопитающих, растений, грибов или бактерий, в зависимости от природного хозяина конкретного типа вирусов. Но при некоторых условиях могут быть выращены и в клетках другого типа.

В этом случае культура клеток сама служит средой для роста и репликации вируса.

Виды клеточных линий

Перечень клеточных линий

См. также

• Биологическое бессмертие
• Культура ткани
• Органная культура
• Биотехнология

Ссылки и примечания

1. ↑ Раствор Рингера
2. ↑ http://caat.jhsph.edu/pubs/animal_alts/appendix_c.htm
3. ↑ http://lib.e-science.ru/book/104/cont/4_3_1.html
4. ↑ http://www.primer.ru/manuals/cytology/cultural.htm#first_cult
5. ↑ http://www.radionauka.ru/2006/sep/15.shtml
6. ↑ Инкубаторы СО2 Binder (Германия)
7. ↑ Лабораторное оборудование и расходные материалы. Инкубаторы
8. ↑ http://lib.e-science.ru/book/104/cont/4_3_3.html
9. ↑ http://www.homeoint.org/kotok/vaccines/contamination.htm
10. ↑ Механизм инфицирования вируса
11. ↑ Кому принадлежит наше тело? В.Богомолова

• http://www.liv.ac.uk/~sd21/tisscult/what.htm