Трансфекция

Трансфе́кция — процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки человека и животных невирусным методом ^[1]. Аналогичный процесс в отношении бактерий, дрожжей и растений называется трансформация.

Трансфекция обычно включает образование в плазматической мембране отверстий через которые внутрь клетки может проникать внеклеточный материал. Трансфицирован может быть генетический материал, такой как ДНК или РНК, а также белки, например, антитела. Для трансфекции часто используют сильное электрическое поле (электропорация) или электростатически заряженные липиды, способные к образованию липосом, структур, которые сливаются с плазматической мембраной, выбрасывая внутрь клетки заключенный в них материал. Известны и другие методы трансфекции.

Первоначальный смысл слова трансфекция: инфекция для трансформации, т.е. введение в клетки вирусного генома, в результате чего начинается инфекция. Но, поскольку в приложении к человеку и животным термин трансформация имеет иное значение (генетические изменения, позволяющие вести клетки в культуре в течение длительного времени, преодолевая лимит Хейфлика, что типично, например, для раковых клеток), термин трансфекция было предложено использовать как замену термину трансформация в смысле изменения фенотипа путем введения чужеродной нуклеиновой кислоты.

Методы трансфекции

Материалы, используемые для трансфекции, относятся к трем основным типам: микрочастицы, катионные полимеры и липосомы.

Один из самых дешевых и наименее надежных методов является кальций-фосфатная трансфекция, изобретенная в 70-х годах ХХ века ^[2][3]). Изотонический раствор, содержащий буфер HEPES, фосфат и ДНК, смешивают с хлористым кальцием. Образуется осадок из частиц фосфата кальция и ДНК, размер которых лежит в нанометровом диапазоне. Суспензию добавляют к культуре клеток, которые поглощают частицы (как именно, авторы не уточняли). Лучше всего такая трансфекция проходит с эмбриональными клетками почки человека линии 293, но с несколько меньшей эффективностью трансфицируются и многие другие линии.

Более эффективен метод, в котором используют липосомы, структуры, много меньшие по размерам, чем клетки, состоящие из липидной мембраны, окружающей ДНК в водной фазе. Их строение напоминает строение клеток, которые тоже окружены фосфолипидной мембраной. Липосомы могут сливаться с клеточной мембраной, после чего их внутреннее пространство сливается с содержимым клеток. Для образования липосом обычно используют положительно заряженные липиды, т.к. ДНК и клеточные фосфолипиды заряжены отрицательно, а частицы с разным электростатическим зарядом притягиваются друг к другу.

Еще один метод трансфекции - использование положительно заряженных водорастворимых полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин. Отрицательно заряженная ДНК связывает поликатионы, и образовавшийся комплекс поглощается клетками путем эндоцитоза.

ДНК может быть также введена в клетки путем микроинъекции или с помощью "генной пушки". Последняя использует микрочастицы инертного твердого вещества (обычно золота), к которым пришита ДНК.

Среди прочих методов трансфекции можно упомянуть электропорацию, нуклеофекцию, тепловой шок, использование магнитных частиц, и множество коммерческих реагентов, распространяемых изготовителями продукции для научных исследований.

Кроме того, ДНК может быть доставлена в клетки вирусами. В таком случае процесс называют трансдукция, а клетки трансдуцированными.

Трансфекция стабильная и транзиентная

Нередко для решения поставленной задачи достаточно ввести ДНК в клетки лишь на какое-то время, достаточное для ее экспрессии. Т.к. трансфицированная ДНК обычно не включается в ядерный геном и не реплицируется, чужеродная ДНК быстро теряется по мере размножения клеток. Такая трансфекция называется транзиентной.

Если необходимо закрепить введенный ген и в потомстве трансфицированых клеток, то его следует включить в ядерный геном. Такая трансфекция называется стабильной. Для этого в клетки вводят еще один ген, который облегчает селекцию трансфицированных клеток и поэтому именуется маркером селекции. Например, маркером селекции может быть ген резистентности к некоторому антибиотику. Некоторые клетки совершенно случайно включают чужеродную ДНК в свой геном, и задача в таком случае, состоит лишь в том, чтобы отобрать потомство таких клеток (клон), что несложно сделать в присутствии антибиотика, губительного для всех клеток кроме трансфицированных.

В качестве антибиотиков, применяемых для селекции трансфицированных клеток, часто применяют генетицин, известный также как G418, пуромицин, доксимицин и др.

Встраивание чужеродной ДНК в клеточный геном происходит благодаря наличию в клетке механизма репарации. Поэтому эффективность встраивания увеличивается, если вводимая в клетки ДНК является линейной, а не кольцевой, какими обычно бывают бактериальные плазмиды. Конечно, наличие в клетках рестриктаз в какой-то мере обеспечивает случайную линеаризацию кольцевых плазмид, но она может происходить и по гену селекции или гену, который должен быть встроен в геном. Поэтому обычно при подготовке стабильной трансфекции генноинженерные конструкции предварительно линеаризуют.

Еще большей подготовительной работы требует встраивание гена в определенное место в геноме, что требуется, например, для генетического нокаута. В таком случае в геннноинженерной конструкции кассета вводимых в хромосому генов должна находиться между двух участков, комплементарных хромосомной ДНК, длиной 1000-3000 пар нуклеотидов (так называемых плеч).

Примечания

1. ↑ Transfection
2. ↑ Graham FL, van der Eb AJ (1973). «A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA». Virology 52 (2): 456–67. DOI:10.1016/0042-6822(73)90341-3. PMID 4705382.
3. ↑ Bacchetti S, Graham F (1977). «Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA». Proc Natl Acad Sci U S A 74 (4): 1590–4. DOI:10.1073/pnas.74.4.1590. PMID 193108.

Литература

• Сингер М., Берг П. Гены и геномы. — Москва, 1998.
• Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. - 1989.

Ссылки

• Крупнейший в России портал молекулярных биологов
• Alberts et al. Molecular Biology of the Cell
• T.A.Brown. Genomes