Конфокальный микроскоп

Современный конфокальный микроскоп

Конфокальный микроскоп — оптический микроскоп, обладающий значительным контрастом по сравнению с обычным микроскопом, что достигается использованием апертуры, размещённой в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света.^[1].

Эта методика завоевала популярность в научных исследованиях в биологии, физике полупроводников и спинтронике (в частности, в изучении свойств NV-центров).

История

В 50-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения меченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей^[2]. Для разрешения этой проблемы Марвин Минский, профессор Массачусетского технологического института в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент^[3].

Принцип работы

Cхема конфокального микроскопа. Рассеянный свет, идущий из глубины образца (пунктирные линии синего цвета), отрезаются апертурами, что обеспечивает высокий контраст изображения

Конфокальный микроскоп имеет разрешение $~\delta$ такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом.

$~\delta = \frac{\lambda}{\pi (NA)}$

где $~\lambda$ длина волны излучения, $~(NA) = n \sin\alpha$ — числовая апертура объектива, $~n$ — показатель преломления среды между образцом и объективом, $~\alpha$ — половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51) Однако, в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3—10 нм ^[4].

Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе.

Изображение представляет собой двумерную (2D) картину.

См. также

• Флуоресцентная микроскопия

Преимущества в биологии перед другими микроскопами

Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях — высота, ширина, глубина и время.^[5]

Пример изображения в конфокальном микроскопе β-tubulin in Tetrahymena (a ciliated protozoan)

.

Примечания

1. ↑ Handbook of Biological Confocal Microscopy / Pawley JB. — 3rd ed. — Berlin: Springer, 2006. — ISBN 0-387-25921-X
2. ↑ Конфокальная микроскопия
3. ↑ US 3013467
4. ↑ Stefan W. Hell (2007). «Far-Field Optical Nanoscopy». SCIENCE 316: 1153-1158. DOI:http://www.mpibpc.mpg.de/groups/hell/.
5. ↑ SP Equipment " Лабораторное оборудование " Оптическая микроскопия Olympus " Mикpocкoпы для мeдицины и биoлoгии " Конфокальные микроскопы " Конфокальный микроскоп Оlymрus FV300

Ссылки

• Molecular Expressions: Laser Scanning Confocal Microscopy
• Nikon’s MicroscopyU. Comprehensive introduction to confocal microscopy.
• Emory’s Physics Department. Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy — high res images also available.
• Programmable Array Microscope — Confocal Microscope Capabilities.