Химическое тестирование грибов

Химическое тестирование грибов

Химическое тестирование — исследование изменения цвета различных макро- и микроскопических структур грибов под действием некоторых химических реактивов. Используется при идентификации образцов грибов для различения таксономических групп. Таксономическим признаком может служить как положительный или отрицательный результат теста, так и вариации в изменении окраски при положительных реакциях, поскольку один и тот же реактив может давать разное окрашивание у разных видов грибов.

Могут проводиться простые тесты по выявлению характерных реакций мякоти плодового тела в целом или микроскопические исследования, обнаруживающие цветные реакции гиф, спор, базидий и других элементов трамы или мицелия. Тесты могут проводится на свежесобранных экземплярах грибов, а некоторые и на гербарных образцах.

Значение и история метода

Макроскопические признаки плодовых тел, а иногда и признаки, обнаруживаемые при микроскопическом исследовании могут быть недостаточными для однозначного определения. В таких случаях используют цветные химические реакции как дополнительный критерий таксонов.

Применяемые аналитические реактивы в большинстве случаев не являются специфическими для определённых веществ или комплексов веществ, содержащихся в грибах, однако они часто оказываются специфичными для определённых таксонов грибов, что и позволяет широко использовать метод. Некоторые из используемых реакций являются специфическими, например, положительная реакция с бензидином и α-нафтолом указывает на наличие в мякоти гриба фермента лакказы, с фенолом — тирозиназы, а тест на амилоидность позволяет не только определить наличие в клетках специфичных полисахаридов (глюканов), но и сделать определённые выводы о строении их макромолекул.

Впервые химический метод был применён в 1866 г. финским ботаником У. Нюландером для систематики лишайников. Нюландер заметил, что разные виды по-разному реагируют на воздействие растворами щелочей, гипохлоритов, иода, солей железа и другими реактивами. Позже Мюллер изучал действие химических реактивов на полипоровые грибы и обнаружил появление фиолетовой окраски у Hapalopilus nidulans, Харлей открыл исчнзновение фиолетовой окраски мякоти чёрного груздя под действием щёлочи. В течение всего XX века действие химических реактивов на грибы изучалось многими известными микологами (Мельцер, 1924; Шеффер и Мёллер, 1938; Кюнер и Романьези, 1953; Зингер, 1951, 1962, 1969, 1975; Майкснер, 1975; Вассер, 1980, 1992). Наиболее полные данные о химических цветовых реакциях грибов содержатся в работах Кюнера и Романьези, Зингера (1975), Майкснера, Вассера.

В отношении самого́ химического метода среди микологов существуют два противоположных мнения:

• На основании только химических реакций описываются новые таксоны, иногда даже роды, при этом совершенно не учитываются другие критерии, особенно условия произрастания грибов.
• Некоторые же учёные не придают значения методу как дополнительному критерию таксонов.

Вассер (1980) приводит две цитаты, характеризующие оба существующих подхода:

Время от времени делаются попытки использования химических опытов для определения видов грибов и лишайников, что часто вызывает бурю протестов. Однако в группе, которая представляет трудность для классификации и количество признаков которой невелико или, наоборот, очень разнообразно, поступление дополнительных сведений должно только приветствоваться.

— А. Берджес^[1]

Химический метод как один из удобных, быстрых и надёжных, как дающий дополнительную информацию в суждениях о виде и других таксонах, следует широко использовать, но непременно вместе с другими методами систематики, особенно морфологическими.

— А. Н. Окснер^[2]

Часто используемые реактивы (для макрореакций)

Даны примеры цветовых реакций, характерных для порядка Agaricales, реакции у других таксонов могут отличаться.

• Аммиак (пары́ нашатырного спирта) даёт зелёное, реже жёлтое окрашивание.
• Анилин (в виде водных растворов солей) при положительной реакции даёт окрашивание красных, жёлто-оранжевых или оливковых тонов.
• Бензидин (спиртовой раствор) даёт голубую окраску, свидетельствуюшую о наличии лакказы. Реагент является сильным канцерогеном, поэтому его на практике заменяют -толидином (диметилбензидином), который значительно менее опасен и даёт ту же реакцию (Х. Клеменсон [Clemenson, Schweiz. Zeitschr. f.Pilzk., 1969, 47]).
• Гваякол (спиртовой раствор или настойка семян растения Guajacum officinale) даёт окрашивание в голубовато-зелёные, голубовато-серые, оливковые или красно-коричневые тона.
• Концентрированные растворы кислот могут давать различные цветовые реакции, используются на свежем материале:
  • 60—70% серная кислота,
  • 65% азотная кислота,
  • 25% соляная кислота,
  • Молочная кислота.
• Лактофенол — смесь равных частей молочной кислоты и фенола, при положительной реакции даёт окрашивание коричневых, розово-фиолетовых, лиловых, красноватых оттенков.
• Карболовая кислота (2,5% раствор фенола) даёт красноватую, желтоватую, коричневую или фиолетовую окраску. Реакция считается положительной, если окраска появляется в течение 20 минут.
• α-Нафтол (водно-спиртовой раствор) окрашивает в фиолетовый или красноватый цвет, реакция проходит за 2—4 минуты.
• Пирамидон (водный раствор) даёт реакцию с окрашиванием в сиренево-фиолетовый цвет.
• Пирогаллол (спиртовой раствор) окрашивает в коричневые тона.
• Сульфованилин — раствор 1 г ванилина в смеси 8 мл конц. серной кислоты и 3 мл дистиллированной воды на свежем материале даёт окрашивание в пурпурные, коричневые, розово-фиолетовые цвета. Впервые применён Арнуольдом и Горисом в 1907 г.
• Сульфоформалин — смесь формалина и 60—70%-ной серной кислоты. Используется на свежем материале и на образцах, хранившихся в формалине не более 6 месяцев. При положительной реакции медленно появляется коричневое окрашивание.
• Феноланилин — смесь 3 капель анилина, 5 капель конц. серной кислоты и 10 мл карболовой кислоты. Положительная реакция заключается в появлении окраски ржаво-розового, пурпурно-красного или лилово-розового цвета, который затем переходит в шоколадно-коричневый.
• Формалин окрашивает в фиолетово-коричневый или красноватый цвет.
• 10% раствор хлорида железа (III) даёт зеленоватое окрашивание, затем переходящее в тёмно-серый цвет.
• 10% раствор сульфата железа (II) с добавлением серной кислоты окрашивает мякоть в зелёный, оливковый, оранжевый или коричневый цвет.
• 40% растворы щелочей (гидроксида калия или натрия) дают окрашивание в розовый, жёлтый, красно-коричневый или оранжевый цвет, реакция пригодна и для гербарного материала.

Другие методики

Тест на амилоидность

Амилоидностью называют способность структур окрашиваться под действием растворов иода. Обычно применяется реактив Мельцера: к водному раствору, содержащему 2,5% иода и 7,5% иодида калия добавляют равный объём хлоралгидрата. Реакция применяется как макроскопическая и для окрашивания препаратов при микроскопировании, что даёт возможность определить амилоидность различных структур: спор, гиф, базидий. Амилоидность проявляется и у образцов, длительное время (более 100 лет) хранившихся в гербарии (по данным Зингера, 1975). Наличие и степень амилоидности позволяет определить особенности строения молекул глюканов — полисахаридов, сходных с крахмалом, а также мощность глюканового слоя на поверхности микроскопических структур гриба. Иод адсорбируется в случае сильно развитого поверхностного слоя в каналах между глюкановыми цепочками. Если цепочки сильно разветвлённые, реакция даёт жёлто-коричневую окраску, при наличии менее разветвлённых цепочек проявляется собственно амилоидная реакция — интенсивное посинение, аналогичное известной в аналитической химии иодокрахмальной реакции. Обычно различают структуры неамилоидные (не окрашиваются), декстриноидные, или псевдоамилоидные (окрашиваются в жёлтые и коричневые тона) и амилоидные (окрашиваются в голубой, синий, до почти чёрного).

В 2005 г. В. А. Спирин предложил определять степени градации этой реакции в соответствии со шкалой цветов (в скобках — обозначение цвета по шкале Дж. Петерсена [Petersen, 1996]):

• слабодекстриноидная — от бледно-коричневого (P14) до бледно-оливкового (P16)
• декстриноидная — желтовато-бурый (P9)
• сильнодекстриноидная — оранжево-бурый (P7)
• неясно-амилоидная — от бледно-мышино-серого (P53) до бледно-фиолетово-серого (P59)
• слабоамилоидная — мышино-серый (P55)
• амилоидная — от голубовато-серого (P57) до тёмно-голубовато-серого (P56)
• сильноамилоидная — от винно-серого (P58) до серовато-фиолетового (P44)

Реакция Шеффера

Реакция Шеффера: стеклянной палочкой наносят на срез полоску раствора анилина, а затем, пересекая её, полоску 65%-ной азотной кислоты. При положительной реакции в месте пересечения появляется хромово-жёлтое пятно, затем окраска переходит в оранжево-красную. Реакция Шеффера — важный внутриродовой признак для рода Agaricus. Пригодна для материала, длительно хранившегося в гербарии. Открыта Ю. Шеффером в 1933 г.

Применение красителей

Окрашивание органическими красителями применяется как для улучшения оптических свойств микроскопических препаратов, так и для характеристики окрашенных структур. Например, при окрашивании толуидиновыми красителями (крезил синий) различают цианофилию — синеватое окрашивание и метахромазию — красновато-розовое или красновато-фиолетовое окрашивание.

Примечания

1. ↑ Вассер цитирует по кн. Singer R. The Agaricales in modern taxonomy. — Vaduz: Cramer, 1975.
2. ↑ Окснер А. Н. Определитель лишайников СССР. — Л.: «Наука», 1974. — (Вып.2).

Литература

• Вассер С. П. Аманитальные грибы Украины. — Киев: «Наукова думка», 1992. — С. 15—16. — ISBN 5-12-003226-5
• Вассер С. П. Флора грибов Украины. Агариковые грибы. — Киев: «Наукова думка», 1980. — С. 43—55.
• Змитрович И. В. Семейства ателиевые и амилокортициевые. — М. — СПб.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. — С. 24—25. — (Определитель грибов России. Порядок афиллофоровые; Выпуск 3). — ISBN 978-5-87317-561-1