Проточная цитометрия

Проточная цитометрия — метод оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Образцы

• кровь
• костный мозг
• ликвор
• суставная жидкость
• плевральная жидкость
• асцитическая жидкость
• суспензированные клетки тканей (например, опухолей)

Принцип

Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

• рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).
• рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а также о неоднородности и гранулярности клеток).
• интенсивность флуоресценции по нескольким каналам флуоресцентности (от 2 до 18-20)- позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.

Флуорохромы

• Флуоресцеина изотиоцианат (FITC)
• Фикоэритрин (PE, RD1)
• Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)
• Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

• Фикоэритрин — Техасский красный (ECD)
• Фикоэритрин — Cy5 (PC5)
• Фикоэритрин — Cy7 (PC7)
• Аллофикоцианин- Cy7 (APC-Cy7)

«Квантовые точки» QD560, QD590 и т. д.

Преимущества

• короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости
• анализ большого количества клеток (до 10⁸ клеток)
• логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток
• измерение параметров редко встречающихся клеток
• объективное измерение интенсивности флуоресценции

Применение

Иммунология

• иммунофенотипирование клеток периферической крови
• определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей)
• определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА + иономицин, ЛПС, ФНО-альфа)
• определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FoxP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов
• определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина)
• исследование клеточного цикла
• оценка клеточной цитотоксичности

Онкология

• количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК)
• анализ стадий клеточного цикла
• выявление анеуплоидного клона
• определение пролиферативной активности анеуплоидного клона
• определение специфических маркеров
• позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска
• оценка состояния иммунной системы:
• оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов)
• оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.)

Цитология

• определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток
• оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов
• определение экспрессии поверхностных антигенов
• анализ стадий клеточного цикла
• измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca²⁺, потенциал наружной клеточной мембраны)

Гематология

• анализ субпопуляционного состава клеток периферической крови
• подсчет ретикулоцитов, анализ тромбоцитов по специфическим маркерам
• дифференциальная диагностика лимфопролиферативных заболеваний и реактивных лимфоцитозов
• диагностика лимфопролиферативных заболеваний
• диагностика острых лейкозов
• оценка минимальной резидуальной болезни

Фармакология

• измерение экспрессии маркеров
• измерение активности внутриклеточных ферментов
• определений стадий клеточного цикла в рамках изучения механизмов воздействия различных биологически активных веществ на клеточном уровне

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100—1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом.

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т. п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов (отношение CD4+/CD8+). Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Литература

1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.

Для улучшения этой статьи желательно?: Найти и оформить в виде сносок ссылки на авторитетные источники, подтверждающие написанное. Добавить иллюстрации.