ДНК-маркер

Рис.1 Электрофорез ПЦР продуктов в агарозном геле и окрашенных бромистым этидием, полученных методом IRAP амплификации. Левая дорожка — ДНК известной длины (от 900 до 3000 пар нуклеотидов)

Рис 2. Стратегии молекулярных маркеров на основе ПЦР ретротранспозонов. A — Sequence Specific Amplification Polymorphism (SSAP), геномная ДНК после рестрикции с помощью PstI и MseI лигируется с адапторами к данным рестрикционным сайтам с последующей ПЦР с праймерами из LTR и адаптора; B — Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism (IRAP), ПЦР между инвертированными праймерами (праймером) из LTR ретротранспозона; C — REtrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism (REMAP), ПЦР между праймером из LTR ретротранспозонаи праймером из простого микросателлитного повтора (например, 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G); D — Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms (RBIP), мультилокусная ПЦР с использованием праймеров фланкирующих ретротранспозицию и праймера с LTR ретротрапозона.

ДНК-маркеры или молекулярно-генетические маркеры, полиморфный признак, выявляемый методами молекулярной биологии на уровне нуклеотидной последовательности ДНК, для определенного гена или для любого другого участка хромосомы при сравнении различных генотипов, особей, пород, сортов, линий.

За последние годы накопился большой массив данных об эффективности использования молекулярно-генетических маркеров, как на уровне белков, так и ДНК, РНК, для решения многих задач генетики, селекции, сохранения биоразнообразия, изучения механизмов эволюции, картирования хромосом, а также для семеноводства и племенного дела.

Наиболее широко используемые молекулярно-генетические маркеры условно можно подразделить на следующие типы — маркеры участков структурных генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков (электрофоретические варианты белков), маркеры некодирующих участков структурных генов и маркеры различных последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам, как правило, неизвестно — распределение коротких повторов по геному (RAPD — случайно амплифицируемая полиморфная ДНК; ISSR — инвертированные повторы; AFLP — полиморфизм в сайтах рестрикции) и микросателлитные локусы (тандемные повторы с длиной элементарной единицы в 2-6 нуклеотидов).

Имеется целый набор современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие:

• анализ полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК (RFLP);
• анализ полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и другие методы на основе амплификации ДНК между повторяющимися последовательностями в геномной ДНК.

Маркеры на основе ДНК-зондов

• RFLP (ПДРФ-маркеры) — Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов. ПДРФ — оценка полиморфизма длин рестриктных фрагментов ДНК может быть осуществлена разными способами, но наиболее традиционен метод с использованием блот-гибридизации)^[1]. Этот метод включает в себя выделение ДНК, получение фрагментов рестрикции, их электрофоретическое разделение, перенос на фильтры с последующей гибридизацией специфических ДНК-зондов с полученными фрагментами ДНК. ДНК-зонд — относительно короткая последовательность клонированной ДНК с определенным уровнем гомологии и способностью гибридизоваться с соответствующим участком геномной ДНК. Комбинации рестриктаз и зондов дают высоко-воспроизводимые полиморфные спектры фрагментов ДНК, специфичные для каждого индивидуума. Различия между последними могут быть обусловлены, например, мутациями, меняющими сайт рестрикции. ПДРФ имеет ряд важных преимуществ, в числе которых высокая воспроизводимость спектров в разных лабораториях, кодоминантное «поведение» маркера. ПДРФ эффективен при картировании генома, маркировании генов многих биологических и экономически важных признаков.
• VNTR — (англ. Variable Number Tandem Repeat), метод получил название ДНК фингерпринта (отпечатки пальцев)^[2]. Тандемные повторы широко распространены в разных геномах и высокополиморфны. В результате высокой вариабельности этих участков ДНК ПДРФ-анализ с зондами к микро- и минисателитным последовательностям позволяет получать мультилокусные спектры с высоким разрешением на популяционном уровне. Благодаря очень высокому уровню полиморфизма этот подход в настоящее время является хорошим инструментом для анализа внутри- и межпопуляционной изменчивости и определения генетических расстояний между группами организмов. VNTR-аллельные варианты имеют кодоминантный характер наследования.

ПЦР-маркеры

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая RAPD технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью^[3],^[4],^[5].

• SSR — (англ. Simple Sequence Repeats), ПЦР с флангирующими праймерами к короткому мини или микросателитному повтору позволяет выявлять маркеры с кодоминантным наследованием и, соответственно, удобен для выявления гетерозигот по данному локусу. Однако, одна пара праймеров для флангов в ПЦР позволяет рассматривать полиморфизм только одного локуса. Для многих микросателлитных локусов не удается выявить полиморфизм. Как правило, фланкирующие последовательности для данного микросателлитного локуса оказываются видоспецифичными.
• RAPD — англ. Random Amplified Polymorphic DNA), полимеразная цепная реакция с использованием единичного короткого, обычно, 10-членным праймеров, с произвольной нуклеотидной последовательностью^[6],^[7]. Последовательность праймеров не абсолютно любая, а ограничена в пределах 40-70 % GC-состав и 50-100 % лингвистической сложности нуклеотидной последовательности. В RAPD можно использовать как одиночный праймер, так и несколько RAPD праймеров. Продукт RAPD образуется в результате амплификации фрагмента геномной ДНК, фланкированной инвертированной последовательностью используемого праймера. Метод универсален для исследований разных видов, при использовании одних и те же праймеров. Как правило, праймер выявляющий высокий полиморфизм для одного вида, будет также эффективен и для других видов.
• ISSR — (англ. Inter Simple Sequence Repeats)^[8],^[9], специализированный вариант RAPD метода, в котором праймер состоит из микросателлитной последовательности. В этом методе, также как и в RAPD, используется один или несколько праймеров, длиной в 15-24 нуклеотида. Но в данном случае, праймеры состоят из тандемных коротких 2-4 нуклеотидных повторов, например: 5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA G и одним или двумя селективными нуклеотидами на 3’-конце праймера. Продукты ISSR амплификации содержат на флангах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как в данном методе последовательность праймеров специфична и подбирается более строго, чем в RAPD, поэтому, температуру отжига в ПЦР можно проводить выше (55-60°С), чем для RAPD метода, а поэтому фингерпринт, обычно, лучше воспроизводим.
• AFLP — (англ. Amplified Fragment Length Polymorphism)^[10], технология представляет собой комбинацию между ПДРФ и ПЦР методов. AFLP — сложный метод и состоит из нескольких этапов: геномная ДНК одновременно рестрицируется двумя рестриктазами (EcoRI и MseI), узнающими 4 и 6 оснований, соответственно, получая фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная геномная ДНК лигируется с адаптором, содержащим «липкие» концы для рестрикционных сайтов (EcoRI и MseI). После этого проводится две последовательных ПЦР. В первой ПЦР (преамплификация) используются праймеры полностью комплементарные адапторам EcoRI и MseI. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации между EcoRI и MseI адапторами, которые трудно дифференцировать с помощью электрофореза. Поэтому, во второй ПЦР, праймеры с EcoRI и MseI адапторами содержат на 3’-конце дополнительные и не комплементарные адапторам от 1 до 3 основания, для селективной амплификации. Разделение фрагментов ДНК выполняется в полиакриламидном геле, с радиоактивной или флюоресцентной меткой, соответственно.
• SSAP — (англ. Sequence Specific Amplification Polymorphism)^[11] явился модификацией метода AFLP, для выявления полиморфизма как по сайту рестрикции, так и по вставки в геномную ДНК транспозона или ретротранспозона. Геномная ДНК исследуемых образцов расщепляется рестриктазами PstI и MseI, получаются фрагменты с выступающими 3’-концами. Затем рестрицированная ДНК лигируется с PstI и MseI адапторами. Первая полимеразная цепная реакция (преамплификация) проводится с праймерами от PstI и МseI адапторов, то есть амплифицируются все возможные комбинации сочетания этих адапторов в рестрицированной геномной ДНК. После первой ПЦР образуется большое количество продуктов амплификации фрагментов ДНК, локализованных между праймерами и адапторами. ПЦР продукты разбавляются и используются для второй, селективной ПЦР. Вторая ПЦР проводится с меченным праймером к LTR и любым праймером адапторов, либо с PstI или MseI. Во второй ПЦР можно использовать праймеры к адаптору с дополнительными нуклеотидами на 3'-конце, например, один, два или три нуклеотида, не комплементарные адаптору. Электрофорез после второй ПЦР проводят в полиакриламидном геле или в секвенаторе, если использовалась флюоресцентная метка. Продукты амплификации после второй ПЦР образуются в результате амплификации фрагмента ДНК между последовательностью LTR ретротранспозона и адаптором. Получение продуктов амплификации между только LTR последовательностями принципиально возможен, но, как правило, расстояние между двумя ретротранпозонами длиннее обычно получаемых размеров ПЦР продуктов (2500 — 3000 пар оснований). А продукты амплификации между адапторами не будут выявляться, поскольку используется метка только для LTR праймера.
• IRAP — (англ. Inter Retrotransposone Amplified Polymorphism)^[12],^[13], полимеразная цепная реакция между праймерами, комплементарными последовательностям двух рядом расположенных LTR ретротранспозона. Метод имеет несколько вариантов. В первом варианте IRAP используется единичный праймер из LTR. Продукты амплификации образуются между двумя инвертированными LTR с одинаковой последовательностью, то есть в одной цепи 5’-конец одного LTR ориентирован к 3’-концу другого LTR. Если центральная часть ретротрапозона длинее обычного размера ПЦР продуктов (около 3000 пар оснований), то ПЦР будет проходить только между двумя LTR из разных ретротранспозиций. В этом случае соседние LTR должны располагаться в инвертирванном положении. В другом варианте IRAP используются два разных праймера к ивертированным LTR: один праймер с 5’-конца, а другой с 3’-конца LTR, ориентированые в разные стороны от ретротранспозона. В данном случае соседние LTR располагаются как прямые длинные повторы. И, наконец, в третьем варианте IRAP используются праймеры к LTR из разных ретротрапозонов в различной ориентации. Можно комбинировать праймеры из LTR с другими праймерами из повторяющейся ДНК.
• REMAP — (англ. Retrotransposone Microsatellite Amplified Polymorphism)^[12],^[13], полимеразная цепная реакция между праймером к фрагменту LTR ретротранспозона и праймером из рядом расположенного, простого микросателлитного повтора (ISSR праймер). В данном случае позиция амплифицируемого фрагмента ретротранспозона «заякоривается» путем использования праймера к микросателлитному локусу. Например, у растений удобным оказывается использование праймера к LTR и праймера к микросателлиту (5’-CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA G) c единичным селективным нуклеотидом на 3’-конце праймера. В REMAP применяют варианты LTR праймеров как для 5’-конца, так и для 3’-конца LTR, как и в IRAP.
• RBIP — (англ. Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms)^[14], метод, основанный на использовании праймеров к последовательностям ретротранспозонов и выявляющий кодоминантные аллельные варианты. Его принцип основан на мультилокусной ПЦР, в которой используются пара праймеров, фланкирующих участок ДНК до ретротранспозиции и праймер к LTR ретротранспозона, который встроен в данный участок между первыми двумя праймерами. В результате ПЦР будет амлифицироваться один из вариантов фрагментов, фланкированных парой праймеров, поскольку последовательность между LTR слишком длинная для ПЦР между сайтами геномной ДНК с ретротранспозоном внутри. Этот метод выявляет полиморфизм только для данного полиморфного локуса. К его достоинствам относят кодоминантность полиморфных вариантов, возможность использования для дот-блот анализа большого количества сортов.
• iPBS — (англ. inter PBS amplification)^[15], метод, основанный на использовании праймеров к PBS (англ. Primer Binding Site, участок связывания тРНК) последовательностям ретротранспозонов. Метод эффективен для выявления полиморфизма между образцами, а также для клонирования новых ретротранспозонов у эукариот.
• Однонуклеотидный полиморфизм (SNP).

Примечания

1. ↑ Southern EM (1974). «Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis». J Mol Biol 98 (3): 503-517. DOI:10.1016/S0022-2836(75)80083-0.
2. ↑ Jeffreys AJ, Wilson V, Thein SW (1984). «Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA». Nature 314: 67-73. DOI:10.1038/314067a0.
3. ↑ Kalendar R (2011). «The use of retrotransposon-based molecular markers to analyze genetic diversity». Field and Vegetable Crops Research 48 (2): 261-274. DOI:10.5937/ratpov1102261K.
4. ↑ Kalendar R, Flavell A, Ellis THN, Sjakste T, Moisy C, Schulman AH (2011). «Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers». Heredity 106: 520-530. DOI:10.1038/hdy.2010.93.
5. ↑ Календарь РН, Глазко ВИ (2002). «Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение». Физиология и биохимия культурных растений 34 (4): 141-156.
6. ↑ Williams JG, Kubelik AR, Livak KJ, Rafalski JA, Tingey SV (1990). «DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers». Nucleic Acids Research 18 (22): 6531-6535. DOI:10.1093/nar/18.22.6531.
7. ↑ Welsh J, McClelland M (1990). «Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers». Nucleic Acids Research 18: 7213-7218. DOI:10.1093/nar/18.24.7213.
8. ↑ Cиволап ЮМ, Календарь РН, Чеботарь СВ (1994). «Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами». Цитология и Генетика 28: 54-61.
9. ↑ Zietkiewicz E, Rafalski A, Labuda D (1994). «Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification». Genomics 20 (2): 176-183. DOI:10.1006/geno.1994.1151.
10. ↑ Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, et al. (1995). «AFLP: a new technique for DNA fingerprinting». Nucleic Acids Research 23: 4407-4414. DOI:10.1093/nar/23.21.4407.
11. ↑ Waugh R, McLean K, Flavell AJ, Pearce SR, Kumar A, Thomas BB, Powell W (1997). «Genetic distribution of Bare-1-like retrotransposable elements in the barley genome revealed by sequence-specific amplification polymorphisms (S-SAP)». Molecular General Genetics 253 (6): 687-694. DOI:10.1007/s004380050372.
12. ↑ ^{1 2} Kalendar R, Grob T, Regina M, Suoniemi A, Schulman AH (1999). «IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques». Theoretical and Applied Genetics 98: 704-711. DOI:10.1007/s001220051124.
13. ↑ ^{1 2} Kalendar R, Schulman AH (2006). «IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting». Nature Protocols 1 (5): 2478-2484. DOI:10.1038/nprot.2006.377.
14. ↑ Flavell AJ, Knox MR, Pearce SR, Ellis THN (1998). «Retrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIP) for high throughput marker analysis». The Plant Journal 16 (5): 643-650. DOI:10.1046/j.1365-313x.1998.00334.x.
15. ↑ Kalendar R, Antonius K, Smykal P, Schulman AH (2010). «iPBS: A universal method for DNA fingerprinting and retrotransposon isolation». Theoretical and Applied Genetics 121 (8): 1419-1430. DOI:10.1007/s00122-010-1398-2.