Анаэробные организмы

Аэробные и анаэробные бактерии предварительно идентифицируются в жидкой питательной среде по градиенту концентрации O₂:
1. Облигатные аэробные (нуждающиеся в кислороде) бактерии в основном собираются в верхней части пробирки, чтобы поглощать максимальное количество кислорода. (Исключение: микобактерии — рост пленкой на поверхности из-за восколипидной мембраны.)
2. Облигатные анаэробные бактерии собираются в нижней части, чтобы избежать кислорода (либо не дают роста).
3. Факультативные бактерии собираются в основном в верхнем (окислительное фосфорилирование является наиболее выгодным, чем гликолиз), однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как от O₂ не зависят.
4. Микроаэрофилы собираются в верхней части пробирки, но их оптимум — малая концентрация кислорода.
5. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрации кислорода и равномерно распределяются по пробирке.

Анаэробы — организмы, получающие энергию при отсутствии доступа кислорода путем субстратного фосфорилирования, конечные продукты неполного окисления субстрата при этом могут быть окислены с получением большего количества энергии в виде АТФ в присутствии конечного акцептора протонов организмами, осуществляющими окислительное фосфорилирование.

Анаэробы — обширная группа организмов, как микро-, так и макроуровня:

• анаэробные микроорганизмы — обширная группа прокариотов и некоторые простейшие.
• макроорганизмы — грибы, водоросли, растения и некоторые животные (класс фораминиферы, большинство гельминтов (класс сосальщики, ленточные черви, круглые черви (например, аскарида)).

Помимо этого анаэробное окисление глюкозы играет важную роль в работе поперечно-полосатой мускулатуры животных и человека (особенно в состоянии тканевой гипоксии).

Термин «анаэробы» ввел Луи Пастер, открывший в 1861 году бактерии маслянокислого брожения. Анаэробное дыхание — совокупность биохимических реакций, протекающих в клетках живых организмов при использовании в качестве конечного акцептора протонов не кислорода, а других веществ (например, нитратов) и относится к процессам энергетического обмена (катаболизм, диссимиляция), которые характеризуются окислением углеводов, липидов и аминокислот до низкомолекулярных соединений.

Степень аэробности среды

Интерполяция руководства к системам BD Gaspak, описывающая условия среды генерируемые пакетом^[1]

Для измерения потенциала среды М. Кларк предложил использовать величину pH₂⁰ — отрицательный логарифм парциального давления газообразного водорода. Диапазон [0-42,6] характеризует все степени насыщения водного раствора водородом и кислородом. Аэробы растут при более высоком потенциале [14-20], факультативные анаэробы [0-20], а облигатные — при наиболее низком [0-10].^[2]

Классификация анаэробов

Согласно устоявшейся в микробиологии классификации, различают:

• Факультативные анаэробы
• Капнеистические анаэробы и микроаэрофилы
• Аэротолерантные анаэробы
• Умеренно-строгие анаэробы
• Облигатные анаэробы

Если организм способен переключаться с одного метаболического пути на другой (например, с анаэробного дыхания на аэробное и обратно), то его условно относят к факультативным анаэробам^[3].

До 1991 года в микробиологии выделяли класс капнеистических анаэробов, требовавших пониженной концентрации кислорода и повышенной концентрации углекислоты (Бруцеллы бычьего типа — B. abortus)^[2]

Умеренно-строгий анаэробный организм выживает в среде с молекулярным O₂, однако не размножается. Микроаэрофилы способны выживать и размножаться в среде с низким парциальным давлением O₂.

Если организм не способен «переключиться» с анаэробного типа дыхания на аэробный, но не гибнет в присутствии молекулярного кислорода, то он относится к группе аэротолерантных анаэробов. Например, молочнокислые и многие маслянокислые бактерии

Облигатные анаэробы в присутствии молекулярного кислорода O₂ гибнут — например, представители рода бактерий и архей: Bacteroides, Fusobacterium, Butyrivibrio, Methanobacterium). Такие анаэробы постоянно живут в лишенной кислорода среде. К облигатным анаэробам относятся некоторые бактерии, дрожжи, жгутиковые и инфузории.

Токсичность кислорода и его форм для анаэробных организмов

Среда с содержанием кислорода является агрессивной по отношению к органическим формам жизни. Это связано с образованием активных форм кислорода в процессе жизнедеятельности или под действием различных форм ионизирующего излучения, значительно более токсичных, чем молекулярный кислород O₂. Фактор, определяющий жизнеспособность организма в среде кислорода^[4] — наличие у него функциональной антиоксидантной системы, способной к элиминации:супероксид-аниона(O₂⁻),перекиси водорода(H₂O₂), синглетного кислорода(O^.), а также молекулярного кислорода (O₂) из внутренней среды организма. Наиболее часто подобная защита обеспечивается одним или несколькими ферментами:

• супероксиддисмутаза, элиминирующая супероксид-анион(O₂⁻) без энергетической выгоды для организма
• каталаза, элиминирующая перекись водорода(H₂O₂) без энергетической выгоды для организма
• цитохром- фермент, отвечающий за перенос электронов от NAD•H к O₂. Этот процесс обеспечивает существенную энергетическую выгоду организму.

Аэробные организмы содержат чаще всего три цитохрома, факультативные анаэробы — один или два, облигатные анаэробы не содержат цитохромов.

Анаэробные микроорганизмы могут активно воздействовать на среду^[2] , создавая подходящий окислительно-восстановительный потенциал среды (напр. Cl.perfringens). Некоторые засеянные культуры анаэробных микроорганизмов, прежде чем начать размножаться, снижают pH₂⁰ с величины [20-25] до [1-5], ограждая себя восстановительным барьером, другие — аэротолерантные — в процессе жизнедеятельности продуцируют перекись водорода, повышая pH₂^0[5].

Дополнительная антиоксидантная защита может обеспечиваться синтезом или накоплением низкомолекулярных антиоксидантов: витамина С, А, E, лимонной и других кислот.

Получение энергии путем субстратного фосфорилирования. Брожение. Гниение.

Схема гликолиза с образованием молочной кислоты

• Также анаэробные организмы могут получать энергию путем катаболизма аминокислот и их соединений (пептидов, белков). Такие процессы именуют гниением, а микрофлору в энергетическом обмене которой преобладают процессы катаболизма аминокислот называют гнилостной.
• Анаэробные микроорганизмы расщепляют гексозы (например, глюкозу) разными путями:
  • Гликолиз (Путь Эмдена-Мейергофа) после которого продукт подвергается брожению
  • окислительный пентозофосфатный путь (другие названия: Фосфогликонатный путь, иначе гексозомонофосфатный(ГКМ), иначе путь Варбурга — Диккенса — Хореккера)
  • Путь Энтнера — Дудорова (особенно значимый, когда субстратами служат глюконовая, маннановая, гексуроновые кислоты или их производные)

В качестве примера организма, сбраживающего сахара по пути Энтнера — Дудорова, можно привести облигатно анаэробную бактерию Zymomonas mobilis. Однако ее изучение позволяет предполагать, что Z. mobilis — вторичный анаэроб, произошедший от цитохромсодержащих аэробов. Путь Энтнера — Дудорова обнаружен и у некоторых клостридиев, что еще раз подчеркивает неоднородность эубактерий, объединенных в эту таксономическую группу.^[6].

При этом характерным только для анаэробов является гликолиз, который в зависимости от конечных продуктов реакции разделяют на несколько типов брожению:

• молочнокислое брожение — род Lactobacillus,Streptococcus, Bifidobacterium, а также некоторые ткани многоклеточных животных и человека.
• спиртовое брожение — сахаромицеты, кандида (организмы царства грибов)
• муравьинокислое — семейство энтеробактерий
• маслянокислое — некоторые виды клостридий
• пропионовокислое — пропионобактерии(например, Propionibacterium acnes)
• брожение с выделением молекулярного водорода — некоторые виды клостридий, ферментация Stickland
• метановое брожение — например, Methanobacterium

В результате расщепления глюкозы расходуется 2 молекулы, а синтезируется 4 молекулы АТФ. Таким образом общий выход АТФ составляет 2 молекулы АТФ и 2 молекулы НАД·Н₂. Полученный в ходе реакции пируват утилизируется клеткой по-разному в зависимости от того, какому типу брожения она следует.

Антагонизм брожения и гниения

В процессе эволюции сформировался и закрепился биологический антагонизм бродильной и гнилостной микрофлоры:

Расщепление микроорганизмами углеводов сопровождается значительным снижением pH среды, в то время как расщепление белков и аминокислот — повышением (защелачиванием). Приспособление каждого из организмов к определенной реакции среды играет важнейшую роль в природе и жизни человека, например, благодаря бродильным процессам предотвращается загнивание силоса, заквашенных овощей, молочных продуктов.

Культивирование анаэробных организмов

Выделение чистой культуры анаэробов схематично

Культивирование анаэробных организмов в основном является задачей микробиологии.

Сложнее дело обстоит с культивированием анаэробных многоклеточных организмов, поскольку для их культивирования часто необходима специфическая микрофлора, а также определённые концентрации метаболитов. Применяется, например, при исследовании паразитов человеческого организма.

Для культивирования анаэробов применяют особые методы, сущность которых заключается в удалении воздуха или замены его специализированной газовой смесью (или инертными газами) в герметизированных термостатах — анаэростатах^[7].

Другим способом выращивания анаэробов(чаще всего микроорганизмов) на питательных средах — добавление содержащих редуцирующие вещества (глюкозу, муравьинокислый натрий и др.), уменьшающие окислительно-восстановительный потенциал.

Общие питательные среды для анаэробных организмов

Для общей среды Вильсона — Блера базой является агар-агар с добавлением глюкозы, сульфита натрия и двуххлористого железа. Клостридии образуют на этой среде колонии чёрного цвета за счет восстановления сульфита до сульфид — аниона, который соединяясь с катионами железа (II) дает соль чёрного цвета. Как правило, черные на этой среде образования колонии, появляются в глубине агарового столбика.^[8]

Среда Китта — Тароцци состоит из мясопептонного бульона, 0,5% глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для поглощения кислорода из среды. Перед посевом среду прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 — 30 минут для удаления воздуха из среды. После посева питательную среду сразу заливают слоем парафина или вазелинового масла для изоляции от доступа кислорода.

Общие методы культивирования для анаэробных организмов

GasPak — система химическим путем обеспечивает постоянство газовой смеси, приемлемой для роста большинства анаэробных микроорганизмов. В герметичном контейнере, в результате реакции воды с таблетками боргидрида натрия и бикарбоната натрия образуется водород и диоксид углерода. Водород затем реагирует с кислородом газовой смеси на палладиевом катализаторе с образованием воды, уже вторично вступающей в реакцию гидролиза боргидрида.

Данный метод был предложен Брюером и Олгаером в 1965 году. Разработчики представили одноразовый пакет, генерирующий водород, который был позднее усовершенствован ими до саше, генерирующих двуокись углерода и содержащих внутренний катализатор^[9][10].

Метод Цейсслера применяется для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого производят посев на среду Китт-Тароцци, прогревают 20 мин при 80 °C (для уничтожения вегетативной формы), заливают среду вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч в термостате. Затем производят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования интересующие колонии изучаются — их пересеивают на среду Китт-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Фортнера

Метод Фортнера — посевы производят на чашку Петри с утолщенным слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. Одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробной микрофлоры, а затем (после поглощения кислорода) — рост аэробной резко прекращается и начинается рост анаэробной.

Метод Вейнберга используется для получения чистых культур облигатных анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, переносят в сахарный бульон. Затем одноразовой пастеровской пипеткой материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным мясо-пептонным агаром, погружая пипетку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают, что позволяет фиксировать бактериальный материал в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют в термостате, а затем изучают выросшие колонии. При обнаружении интересующей колонии на её месте делают распил, материал быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Перетца

Метод Перетца — в расплавленный и охлаждённый сахарный агар-агар вносят культуру бактерий и заливают под стекло, помещённое на пробковых палочках(или фрагментах спичек) в чашку Петри. Метод наименее надежен из всех, но достаточно прост в применении.

Дифференциально — диагностические питательные среды

• Среды Гисса («пестрый ряд»)
• Среда Ресселя (Рассела)
• Среда Эндо
• Среда Плоскирева или бактоагар «Ж»
• Висмут-сульфитный агар

Среды Гисса: К 1 % пептонной воде добавляют 0,5 % раствор определенного углевода (глюкоза, лактоза, мальтоза, маннит, сахароза и др.) и кислотно-щелочной индикатор Андреде, разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводородов.

Среда Ресселя (Рассела) применяется для изучения биохимических свойств энтеробактерий(шигелл, сальмонелл). Содержит питательный агар-агар, лактозу, глюкозу и индикатор (бромтимоловый синий). Цвет среды травянисто-зелёный. Обычно готовят в пробирках по 5 мл со скошенной поверхностью. Посев осуществляют уколом в глубину столбика и штрихом по скошенной поверхности.

Среда Эндо

Среда Плоскирева (бактоагар Ж) — дифференциально-диагностическая и селективная среда, поскольку подавляет рост многих микроорганизмов, и способствует росту патогенных бактерий (возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии). Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, а лактозоположительные — красные. В составе среды — агар, лактоза, бриллиантовый зелёный, соли желчных кислот, минеральные соли, индикатор (нейтральный красный).

Висмут-сульфитный агар предназначен для выделения сальмонелл в чистом виде из инфицированного материала. Содержит триптический гидролизат, глюкозу, факторы роста сальмонелл, бриллиантовый зелёный и агар. Дифференциальные свойства среды основаны на способности сальмонелл продуцировать сероводород, на их устойчивости к присутствию сульфида, бриллиантового зелёного и лимоннокислого висмута. Маркируются колонии в чёрный цвет сернистого висмута (методика схожа со средой Вильсона — Блера).

Метаболизм анаэробных организмов

Метаболизм анаэробных организмов имеет несколько различных подгрупп:

• Организмы способные использовать анаэробное дыхание (другие окислители — серу, азот (см.Анаэробное дыхание), хлораты, перхлораты, хроматы и перманганаты^[11])
• Использующие циклическое фотосинтетическое фосфорилирование (лучевую энергию (чаще всего Солнца)) — фототрофные анаэробы (см. также Аноксигенный фотосинтез)
• Организмы, энергетический обмен которых опирается на катаболизм высокомолекулярных/высокоэнергетических соединений (например, гликолиз).

Анаэробный энергетический обмен в тканях человека и животных^[12]

Анаэробное и аэробное энергообразование в тканях человека

Некоторые ткани животных и человека отличаются повышенной устойчивостью к гипоксии (особенно мышечная ткань). В обычных условиях синтез АТФ идет аэробным путем, а при напряженной мышечной деятельности, когда доставка кислорода к мышцам затруднена, в состоянии гипоксии, а также при воспалительных реакциях в тканях доминируют анаэробные механизмы регенерации АТФ. В скелетных мышцах выявлены 3 вида анаэробных и только один аэробный путь регенерации АТФ.

3 вида анаэробного пути синтеза АТФ

К анаэробным относятся:

• Креатинфосфатазный (фосфогеный или алактатный) механизм — перефосфорилирование между креатинфосфатом и АДФ
• Миокиназный — синтез (иначе ресинтез) АТФ при реакции трансфосфорилирования 2 молекул АДФ(аденилатциклаза)
• Гликолитический — анаэробное расщепление глюкозы крови или запаса гликогена, заканчивающийся образованием молочной кислоты (иначе именуется «лактатным»).

Необходимо отметить, что прямым следствием гликолиза является критическое снижение рН тканей — ацидоз. Это ведет к снижению эффективного транспорта кислорода гемоглобином, и формирует положительную обратную связь.

Каждый механизм имеет свое время удержания максимальной мощности и оптимум энергообеспечения тканей. Наибольшая мощность и наименьшее время удержания:

• креатинфосфаткиназный механизм (3600 Дж/(кг·мин), при времени 6—12 сек)
• лактатный (2510 Дж/(кг·мин), при времени 30—60 сек)
• аэробный (600 Дж/(кг·мин), при времени около 600 секунд).

Примечания

1. ↑ Газогенерирующие контейнерные системы GasPak: Инструкция МК. — OOO "МК, официальный дистрибьютер Becton Dickinson International", 2010. — С. 7.
2. ↑ ^{1 2 3} К. Д. Пяткин. Микробиология с вирусологией и иммунологией. — М:"Медицина", 1971. — С. 56.
3. ↑ Л. Б. Борисов. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. — МИА, 2005. — С. 154-156. — ISBN 5-89481-278-X
4. ↑ Д. Г. Кнорре. Биологическая химия:Учеб. для хим., биол. и мед.спец.вузов. — 3. — М.:Высшая школа, 2000. — С. 134. — ISBN 5-06-003720-7
5. ↑ D. A. Eschenbach, P. R. Davick, B. L. Williams. Prevalence of hydrogen peroxide-producing Lactobacillus species in normal women and women with bacterial vaginosis. — J Clin Microbiol. 1989 February; 27(2): 251–256.
6. ↑ М. В. Гусев, Л. А. Минеева. Микробиология. — М:МГУ, 1992. — С. 56.
7. ↑ А. А. Воробьев. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. — МИА, 2003. — С. 44. — ISBN 5-89481-136-8
8. ↑ Л. Б. Борисов. Руководство к лабораторным занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. — Медицина, 1992. — С. 31-44. — ISBN 5-2225-00897-6
9. ↑ J. H. Brewer, D. L. Allgeier. Disposable hydrogen generator. — Science 147:1033-1034. — 1966.
10. ↑ J. H. Brewer, D. L. Allgeier. Safe self-contained carbon dioxide-hydrogen anaerobic system. — Appl. Microbiol.16:848-850. — 1966.
11. ↑ G. F. Smirnova. Metabolism peculiarities of bacteria restoring chlorates and perchlorates. — Microbiol Z. 2010 Jul-Aug;72(4):22-8.
12. ↑ Филиппович Ю. Б., Коничев А. С., Севастьянова Г. А. Биохимические основы жизнедеятельности организма человека. — Владос, 2005. — С. 302. — ISBN 5-691-00505-7

См. также

• Аэробы

Ссылки

• Анаэробии (анаэробы) // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб., 1890—1907.
• Анаэробы // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб., 1890—1907.

Для улучшения этой статьи желательно?: Исправить статью согласно стилистическим правилам Википедии. Проставив сноски, внести более точные указания на источники.