V(D)J-рекомбинация

Структура иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора

V(D)J-рекомбинация^[1] или V(D)J-реаранжировка^[2] (англ. V(D)J-recombination, V(D)J rearrangement) — механизм соматической рекомбинации ДНК, происходящий на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов и приводящий к формированию антиген-распознающих участков иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора. Гены иммуноглобулина (англ. Ig) и Т-клеточного рецептора (англ. TCR) состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трем классам: V (variable), D (diversity) и J (joining). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. Объединенная последовательность сегментов V(D)J кодирует вариабельные домены каждой из цепей рецептора или иммуноглобулина ^[2][3].

Эволюционное значение

Основная статья: Адаптивный иммунитет

Система адаптивного (приобретенного) иммунитета способна распознавать миллионы отдельных антигенных детерминант. Эта способность основана на огромном разнообразии (как минимум 10⁹) антиген-специфичных рецепторов лимфоцитов. Если бы весь антиген-распознающий репертуар рецепторов Т- и В-лимфоцитов кодировался отдельными генами, то они не вместились бы в геном. В связи с этим, в эволюции позвоночных животных развилась способность генерировать гены антиген-распознающего рецептора путем рекомбинации отдельных генных сегментов случайным образом в каждом клетке-предшественнике лимфоцита. Поскольку в течение жизни образуются миллиарды лимфоцитов с уникальными антиген-специфическими рецепторами, в совокупности они образуют практически неограниченный репертуар распознаваемых антигенов.^[4]

Гены иммуноглобулинов и рецептора Т-лимфоцитов

Основные статьи: Иммуноглобулины, Т-клеточный рецептор

В отличие от большинства генов, гены рецепторов лимфоцитов Ig/TCR не присутствуют в целом виде в зародышевых и соматических клетках человека. Эти гены находятся в хромосоме в виде повторяющихся сегментов, принадлежащих к трем классам: V (variable), D (diversity) и J (joining), а также один или несколько инвариантных константных регионов С (constant).

Молекулы иммуноглобулина являются гетеродимерами, состоят из двух разных полипептидных цепей — тяжелой и легкой. Существует два типа легкой цепи — каппа и лямбда. Три типа полипептидных цепей закодированы отдельными генами. Т-клеточный рецептор является гетеродимером, состоящим из двух иммуноглобулиноподобных полипептидных цепей. Большинство Т-лимфоцитов несут на своей поверхности TCR II типа, состоящий из альфа- и бета- цепей (TCRαβ). Отдельная популяция Т-лимфоцитов несут на своей поверхности TCR I типа, состоящий из гамма- и дельта- цепей (TCRγδ). Такие лимфоциты имеют особые функции и называются обычно γδ-Т-клетками.

Таким образом, всего семь генных локусов подвержены V(D)J-перестройке: тяжелой цепи иммуноглобулина (IGH@), легких цепей каппа (IGK@) и лямбда иммуноглобулина (IGL@), и четыре гена Т-клеточного рецептора, TCRA, TCRB, TCRG, TCRD. D-сегменты имеются только в гене тяжелой цепи иммуноглобулина (IGH@), TCRB и TCRD^[5].

Локализация локусов Ig/TCR у человека

Иммуноглобулины

• IGH@ — гены, кодирующие тяжелую цепь (14 хромосома)
• IGK@ — гены, кодирующие легкую цепь типа каппа (2 хромосома)
• IGL@ — гены, кодирующие легкую цепь типа лямбда (22 хромосома)

Т-клеточный рецептор

• T-клеточный рецептор II типа (TCRαβ):
  • TCRA — TCR α-цепь (14 хромосома)
  • TCRB — TCR β-цепь (7 хромосома)
• T-клеточный рецептор I типа (TCRγδ):
  • TCRG — TCR γ-цепь (7 хромосома)
  • TCRD — TCR δ-цепь (14 хромосома)

Количество генных сегментов и разнообразие перестроек

Организация локусов генов иммуноглобулинов в геноме человека

Каждый из локусов Ig/TCR содержит определенное количество V, D и J сегментов, расположенных в определенном порядке: сначала идут повторяющиеся V-сегменты, затем D, если они есть, затем J-сегменты и константный регион (С). Часть генных сегментов является псевдогенами, большинство — функциональными генами, то есть транслируются в белок. Количество вариантов случайных комбинаций генных сегментов в процессе V(D)J рекомбинации определяет комбинативное разнообразие антигенных рецепторов лимфоцитов.

Сегмент	иммуноглобулин			TCRαβ		TCRγδ
	каппа (κ)	лямбда (λ)	тяжелая цепь	альфа (α)	бета (β)	гамма (γ)	дельта (δ)
Variable (V)	40	30	65	70	52	12	4
Diversity (D)	0	0	27	0	2	0	3
Joining (J)	5	4	6	61	13	5	4
Вариантов перестроек	200	120	11 000	4 270	1 352	60	48
Разнообразие рецепторов	3,5*106			5,9*106		2880

Механизм

Молекулярный механизм рекомбинации всех семи локусов Ig/TCR идентичный. Эти генные перестройки происходят на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов в костном мозге (для В-лимфоцитов) и тимусе (для Т-лимфоцитов) и представляют собой соматическую негомологичную рекомбинацию, в результате которой V, D и J генные сегменты сближаются, а промежуточная последовательность удаляется. Для локусов IGH@, TCRD, TCRB перестройка протекает в два этапа: сначала сближаются D и J сегменты, а затем происходит V-DJ соединение. Для остальных генов перестройка V-J происходит в один этап.

Сигнальные последовательности

Рекомбинация происходит по сигнальным последовательностям ДНК, непосредственно прилегающим к генным сегментам. Эти консервативные сигнальные последовательности называются RSS (англ. recombination signal sequence) и состоят из семи нуклеотидов — 5’-CACAGTG-3’ (гептамер), за которым следует последовательность из 12 или 23 нуклеотидов — спейсер, и ещё одного консервативного блока из девяти нуклеотидов — 5’-ACAAAAACC-3’. Последовательность спейсера может варьировать, но длина консервативна и соответствует одному (12 нуклеотидов) или двум (23 нуклеотида) виткам двойной спирали ДНК. Перестройка происходит только между двумя RSS, одна из которых имеет спейсер 12 пар нуклеотидов, другая — 23 п. н., так называемое «правило рекомбинации 12/23». Эта закономерность строения RSS определяет правильную последовательность рекомбинации: например ген IGH@ имеет RSS длиной 23 п. н. на 3’-конце каждого V сегмента, RSS длиной 12 п. н. на 3’- и 5’-конце каждого D сегмента и RSS длиной 23 п. н. на 5’-конце каждого J сегмента. Таким образом, V-J реаранжировка этого локуса невозможна^[6].

V(D)J-рекомбинация представляет собой ряд последовательных реакций сближения, разрывов и воссоединений двойной спирали ДНК и протекает в два этапа. На первом этапе продукты генов RAG1 и RAG2 (англ. recombination activation genes) — распознают RSS и связываются с ними. В формировании комплекса участвуют белки HMG-1 и 2 (high mobility group proteins). Рекомбиназы вносят однонитевой разрыв в ДНК на 5’-конце консервативной последовательности и активируют 3’-OH конец кодирующего сегмента, который фосфатную связь во второй нити ДНК с образованием ковалентно замкнутой шпильки на конце сегмента и «тупых» концов гептамера. Первый этап требует присутствия ионов Mg²⁺.

На втором этапе реакции тупые концы гептамеров соединяются, образуя так называемое сигнальное соединение. Кодирующие концы перед объединением подвергаются процессингу. Шпилька расщепляется в случайном месте, оставляя иногда палиндромную последовательность, называемую Р-нуклеотидами, на конце генного сегмента. Перед воссоединением генных сегментов концы ДНК могут немного деградировать при участии экзонуклеаз, а также происходит нематричное добавление нуклеотидов терминальной дезоксинуклеотидил трансферазой (англ. TdT) — так называемых N-нуклеотидов. Наконец, кодирующие концы объединяются. Подобный механизм перестройки называют негомологичной рекомбинацией (англ. NHEJ, non-homologous DNA end-joining). Помимо RAG-рекомбиназ в процессе участвуют другие белки системы репарации/рекомбинации: Artemis осуществляет открытие шпильки, DNA-PK связывается с Artemis для обработки кодирующего конца, белки Ku70 и Ku80 связывают и репарируют двухнитевые разрывы ДНК, белок XRCC4 и ДНК-лигаза IV соединяют кодирующие концы^[5][7].

Перестройка может протекать по двум механизмам. В случае наиболее типичной делеционной перестройки, ДНК между двумя RSS «выпетлевывается», отрезается и образует кольцевой продукт. Инвертированная перестройка возможна, когда V сегмент находится в инвертированном состоянии. В этом случае последовательность, разделяющая две RSS, остается в инвертированном состоянии. Такой тип рекомбинации наиболее характерен для локуса IGK@ (около половины V-J реаранжировок этого гена). Рекомбинация в норме возможна только между двумя RSS, локализованными на одной хромосоме.^[6]

Вариабельность

Средняя длина генного сегмента V — 300, J — 46-63, D — 17-37 пар нуклеотидов. В процессе перестройки, концы генных сегментов могут потерять несколько нуклеотидов, затем они достраиваются случайными нуклеотидами при помощи фермента терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (англ. TdT). Такие случайные нуклеотиды называются нематричными (N), поскольку они синтезируются без матрицы ДНК и не присутствуют в геноме человека. В каждом акте соединения может быть добавлено от 1 до 30 N-нуклеотидов. Место соединения V, D и J называется соединительным участком, и кодирует третью гипервариабельную петлю белковой цепи вариабельного домена иммуноглобулина, находящегося в антиген-связывающем центре рецептора. Неточность соединения генных сегментов и добавление нематричных нуклеотидов является источником вариабельности, которое увеличивает антиген-распознающий репертуар на несколько порядков. Наибольшая вариабельность возникает при рекомбинации генов IGH@ и TCRB^[6].

Связь с генетическими дефектами

Дефект RAG1, RAG2, Ku70, Ku80 или DNA-PK генов человека и мыши приводит к фенотипу тяжелого комбинированного иммунодефицита (англ. scid), тогда как при дефекте TdT развитие лимфоцитов протекает нормально, но разнообразие рецепторов антигенов сильно снижено.

Литература

1. ↑ Д. Мейл, Д. Бростофф, Д. Рот, А. Ройтт Иммунология. — 7 (оригинальное). — Москва: Логосфера, 2007. — С. 105. — 568 с. — ISBN 9785986570105
2. ↑ ^{1 2} Ярилин А. А. Иммунология. — Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — С. 254-259. — 749 с. — ISBN 978-5-9704-1319-7
3. ↑ Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, and Mark J Shlomchik Immunobiology. — 5th edition. — New York: Garland Science, 2001. — С. 123-141. — 732 с. — ISBN 10: 0-8153-3642-X
4. ↑ Immunobiology, 5th edition The Immune System in Health and Disease Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, and Mark J Shlomchik. New York: Garland Science; 2001. ISBN 0-8153-3642-X
5. ↑ ^{1 2} Krangel M.S. Gene segments selection in V(D)J recombination: accessibility and beyond. Nature Immunology, Vol.4, N.7, 2003. PMID: 12830137
6. ↑ ^{1 2 3} Immunobiology, 5th edition The Immune System in Health and Disease Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, and Mark J Shlomchik. New York: Garland Science; 2001. — ISBN 0-8153-3642-X
7. ↑ Cobb RM, Oestreich KJ, Osipovich OA, Oltz EM. Accessibility control of V(D)J recombination. Adv Immunol. 2006;91:45-109. PMID: 16938538