Количественный анализ нуклеиновых кислот

Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

Спектрофотометрический анализ

Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)⁻¹ см⁻¹, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹ и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹). Отсюда, оптическая плотность (англ. OD, optical density) равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD.^[1] Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего сосдества.^[2]

Коэффициенты пересчета

Тип нуклеиновой кислоты	Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260
dsDNA (двуцепочечная ДНК)	50
ssDNA (одноцепочечная ДНК)	37
ssRNA (одноцепочечная РНК)	40

Кюветы для анализа

Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при помощи стандартной кюветы с величиной оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объема

Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры^[3] позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образца

Часто образцы нуклеиновых кислот содержат примеси белков и других органических веществ. Отношение поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A_260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A_260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A_260/230 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280

Для выявления примесей белков в растворах нуклеиновых кислот, анализируют соотношение поглощения растворов на длинах волн 260 и 280 нм, ароматические аминокислоты в составе белков поглощают на 280 нм.^[1][4] Однако вклад примесей белков в определение концентрации нуклеиновых кислот небольшой — для того, чтобы повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты, концентрация белка должна быть значительной.^[1][5]

Отношение 260:280 позволяет определить примесь нуклеиновых кислот в растворах белков и примесей белков в растворах нуклеиновых кислот:

% белка	% нуклеиновой кислоты	отношение 260:280
100	0	0,57
95	5	1,06
90	10	1,32
70	30	1,73

В случае определения примеси белка в растворе нуклеиновой кислоты отношение 260:280 имеет меньшую чувствительность :

% нуклеиновой кислоты	% белка	отношение 260:280
100	0	2,00
95	5	1,99
90	10	1,98
70	30	1,94

Такие отличия обусловлены более высоким значением коэффициента молярной экстинкции в случае нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм, в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Определение белкового загрязнения в растворе нуклеиновой кислоты не может быть определен по соотношению 260:280, поэтому примеси белков в растворах нуклеиновых кислот вносят незначительную погрешность в определение концентрации ДНК и РНК.

Другие загрязнения

• Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A_260/280 около 1.2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A_260/280 около 2.^[1] Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
• Поглощение на длине волны 230 нм могут быть вызваны загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A_260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A_260/230 около 1,8.^[6]
• Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
• Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank). Также отрицательные значения могут быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

Примечания

1. ↑ ^{1 2 3 4} Sambrook and Russell Molecular Cloning: A Laboratory Manual. — 3rd. — Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — ISBN 978-087969577-4
2. ↑ Tataurov A.V.; You Y., Owczarzy R. (2008). «Predicting ultraviolet spectrum of single stranded and double stranded deoxyribonucleic acids». Biophys. Chem. 133 (1-3): 66–70. DOI:10.1016/j.bpc.2007.12.004. PMID 18201813.
3. ↑ Kartha, R. Spectrophotometric Quantification of Nano- and Standard-Volume Samples, (2008, October 7), American Biotechnology Laboratory, http://www.iscpubs.com/Media/PublishingTitles/b0608kar.pdf
4. ↑ Sambrook and Russell cites the original paper: Warburg, O. and Christian W. (1942). «Isolierung und Kristallisation des Gärungsferments Enolase». Biochem. Z. 310: 384–421.)
5. ↑ Glasel J. (1995). «Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios». BioTechniques 18 (1): 62–63. PMID 7702855.)
6. ↑ The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com (13 января 2010). Архивировано из первоисточника 6 сентября 2012. Проверено 12 марта 2010.