Биоортогональные реакции


Биоортогональные реакции

К биоортогональным реакциям относятся любые химические реакции, которые могут протекать внутри живых систем, не мешая естественным биохимическим процессам.[1][2][3] Термин был предложен Каролин Бертоцци (Carolyn R. Bertozzi) в 2003 году.[4] Уже к 2011 году биоортогональные реакции дали возможность изучения биомолекул, например, гликанов, белков[5] и липидов[6], в режиме реального времени в живых системах при отсутствии цитотоксичности. Было разработано несколько химических реакций, отвечающих требованиям биоортогональности, среди них 1,3-диполярное присоединение азидов и циклооктинов (называемое также безмедной клик-реакцией)[7], нитронов и циклооктинов[8], образование оксимов или гидразонов из карбонильных соединений[9], реакция тетразинов с циклооктенами[10], клик-реакция изонитрилов[11], и квадрициклановое лигирование[12].

Использование биоортогональной реакции на практике обычно осуществляют в две стадии. Сначала субстрат (биомолекулу) модифицируют биоортогональной функциональной группой и вводят в клетку. Вводимая группа не должна сильно изменять структуру субстрата, иначе это отразится на его биологической активности. Затем в систему вводят метку, содержащую комплементарную функциональную группу, и в результате биоортогональной реакции происходит модификация (мечение) субстрата.

Несмотря на разработку эффективных биоортогональных реакций, таких как безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение, продолжается поиск новых реакций с целью получить возможность проведения параллельной модификации субстратов в одной и той же биологической системе.

Содержание

Условия биоортогональности

Биоортогональная реакция должна соответствовать следующим условиям.[4]

  • Селективность. Реакция должна протекать селективно между функциональными группами во избежание побочных процессов с участием биологических соединений.
  • Биологическая инертность. Реагирующие группы и образующаяся связь не должны в какой-либо мере обладать реакционной способностью, которая может нарушить естественные процессы, протекающие в изучаемом организме.
  • Химическая инертность. Образующаяся ковалентная связь должна быть прочной и инертной по отношению к среде протекания реакции.
  • Кинетика. Реакция должна быть быстрой, чтобы модификация наступила до метаболизма или выведения метки из организма. Благодаря малому времени ответа быстрые реакции могут быть использованы для точного слежения за динамическими процессами.
  • Биосовместимость. Реакция должна быть нетоксичной и протекать в биологических условиях, то есть при определенном рН, температуре и в водной среде.
  • Доступная модификация субстрата. Биоортогональная функциональная группа должна вводиться в биомолекулу метаболическим путем или при помощи белковой инженерии. В оптимальном варианте одна из групп должна быть очень маленькой и не нарушать нативное состояние биомолекулы.

Лигирование по Штаудингеру

Данная реакция была разработана группой Бертоцци в 2000 году на основе классической реакции Штаудингера между азидами и триарилфосфинами.[13] Из этой реакции зародилась область биоортогональной химии, поскольку реагирующие в ней группы не представлены в биомолекулах, однако теперь она не используется так же широко. Лигирование по Штаудингеру было использовано как в живых клетках, так и в мышах.[4]

Биоортогональность

Азидная группа может выступать как мягкий электрофил, реагируя с мягкими нуклеофилами, такими как фосфины. Большинство биологических нуклеофилов, напротив, являются жёсткими нуклеофилами. Реакция протекает в водной среде с образованием стабильного продукта.

Фосфины полностью отсутствуют в живых системах и не восстанавливают дисульфидные связи.

На примере лекарственных препаратов (азидотимидин) было показано, что азиды являются биосовместимыми. Маленький размер азидной группы позволяет легко вводить её в биомолекулы клеточными метаболическими путями.

Механизм

Реакция Штаудингера включает в себя нуклеофильную атаку фосфина на электрофильный атом азота азидной группы с образованием фосфазида, перегруппировку с выделением азота и гидролиз иминофосфорана. Для применения в области биоконъюгации реакция была изменена путем введения сложноэфирной группы в орто-положение одного из арильных заместителей. В результате атаки образующегося иминофосфорана 3 на эту группу образуется бициклический продукт 4, гидролиз которого приводит к образованию устойчивой амидной связи между субстратом и вводимой меткой. Лимитирующей стадией реакции является атака фосфина на азид.[14]

Staudinger lig mech.svg

Ограничения

Фосфины медленно окисляются кислородом в живых системах. Кроме того, они, возможно, метаболизируются цитохромами P450. Реакции протекают достаточно медленно, согласно кинетике второго порядка с константой скорости около 0,0020 М−1 с−1. Попытки ускорить нуклеофильную атаку введением в арильные заместители электронодонорных групп приводят к ускорению реакции, но также увеличивается и скорость окисления фосфинов.

Медленная скорость реакции требует увеличения концентрации используемого фосфина, из-за чего усиливается фоновый сигнал. Предпринимались усилия для преодоления этой проблемы: были синтезированы флуорогенные фосфины на основе флуоресцеина[15] и кумарина[16], однако кинетика реакции остаётся серьёзным препятствием к её широкому использованию.

Безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение

Безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение — это биоортогональная реакция, разработанная К. Бертоцци как активированный вариант реакции Хьюсгена. В отличие от медь-катализируемого азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC, Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition), данный вариант реакции имеет улучшенную кинетику за счёт снятия углового напряжения в молекуле циклооктина при образовании продукта присоединения. Поэтому эта реакция получила известность как азид-алкиновое циклоприсоединение, промотируемое напряжением (SPAAC, Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition). Данная модификация позволяет избежать использования токсичного медного катализатора и использовать безмедную реакцию в живых клетках и организмах.

SPAAC Reaction.svg

Токсичность меди

Классическое медь-катализируемое азид-алкиновое циклоприсоединение является очень быстрой и эффективной реакцией для биоконъюгации, однако оно не может быть использовано в живых клетках из-за токсичности ионов Cu(I). Токсичность объясняется образованием реакционноспособных кислородсодержащих соединений, генерируемых медными катализаторами.

Проводилась оптимизация лигандов для предотвращения вредного воздействия на биомолекулы, однако было показано, что различное лигандное окружение в комплексах также влияет на метаболизм и поглощение клетками, внося нежелательные изменения в клеточные процессы.[17]

Биоортогональность

Азидная группа является биоортогональной, поскольку она достаточно мала (слабо влияет на проникновение молекулы в клетку), метаболически устойчива и не встречается в нативных биомолекулах. Хотя азиды не являются самыми реакционноспособными в 1,3-диполярном присоединении, их предпочитают использовать из-за относительного отсутствия побочных реакций в условиях проведения модификации.[18] Циклооктин не так мал, однако он обладает ортогональностью и стабильностью, необходимыми для модификации in vivo. Циклооктины являются наименьшими устойчивыми циклическими алкинами. Рассчитанное угловое напряжение в их циклах составляет 19,9 ккал/моль.[19]

Механизм

Реакция протекает как стандартное 1,3-диполярное циклоприсоединение с асинхронным согласованным перициклическим сдвигом электронов. Амбивалентная природа 1,3-диполя делает невозможным определение электрофильного и нуклеофильного центра в азиде, поэтому изображение направления перехода электронов не имеет смысла. Тем не менее, расчёты показывают, что внутренний атом азота несет самый большой отрицательный заряд.[20]

Spaac mech.svg

Другие биоортогональные реакции

Дипольное циклоприсоединение нитронов

Безмедное азид-алкиновое циклоприсоединение было адаптировано для использования нитронов вместо азидов. В качестве продуктов реакции образуются N-замещенные изоксазолины. Скорость реакции увеличивается в водной среде и подчиняется кинетике второго порядка с константой от 12 до 32 М−1 с−1 в зависимости от заместителей в нитроне. Несмотря на высокую скорость реакции, её недостатком является затрудненное введение нитрона в биомолекулу метаболическим мечением. Реакция применялась для модификации пептидов, причем нитрон в пептид вводили посттрансляционной модификацией.[8]

Nitrone Dipole Cycloaddition.svg

Циклоприсоединение норборнена

Были разработаны реакции диполярного циклоприсоединения нитрилоксидов к норборнену. Основное использование они находят в модификации ДНК и РНК в автоматических олигонуклеотидных синтезаторах. Норборнен был выбран в качестве диполярофила благодаря балансу между промотируемой напряжением реакционной способности и устойчивостью. Недостатками данной реакции являются высокая электрофильность нитрилоксида, что приводит к побочным реакциям, и низкая скорость.[21]

Norbornenecycloaddnmech.png

Циклоприсоединение оксанорборнадиена

Реакция циклоприсоединения оксанорборнадиена с азидами протекает с последующим элиминированием фурана по ретрореакции Дильса — Альдера. Напряжение цикла и электронная обеднённость оксанорборнадиена увеличивают его реакционную способность в лимитирующей стадии циклоприсоединения. Отщепление фурана происходит быстро с образованием устойчивого 1,2,3-триазола.[22] Предварительные исследования показали полезность данной реакции в модификации пептидов, а также она была использована при создании визуализирующих соединений в ОФЭКТ.[23]

Oxanorbmech.png

Реакция тетразинов с циклооктенами

Циклоприсоединение s-тетразинов и (E)-циклооктенов является реакцией Дильса — Альдера с обращёнными электронными требованиями, за которой следует ретрореакция Дильса — Альдера с выделением азота. Реакция протекает весьма быстро с константой скорости второго порядка, равной 2000 М−1 с−1 (в системе метанол — вода 9:1), что позволяет модифицировать биомолекулы в очень низких концентрациях.

Tetrazinemech.png

Проведенный расчёт показал, что энергия напряжения в (Z)-циклооктенах составляет 7,0 ккал/моль, что меньше, чем в циклооктане (12,4 ккал/моль), из-за потери двух трансаннулярных взаимодействий. Напротив, (E)-конфигурация двойной связи сильно увеличивает напряжение цикла (17,9 ккал/моль).[24] В качестве диенофила используется 3,6-диарил-s-тетразин, который замещен для подавления взаимодействия с водой. Выделение азота на второй стадии делает реакцию необратимой.[25]

Было обнаружено, что вода ускоряет реакцию. В реакцию также вводили норборнены в качестве диенофилов, однако реакция протекала значительно медленнее (1 М−1 с−1 в водной среде). Реакция тетразинов с (E)-циклооктеном применялась для мечения живых клеток[26] и сочетания полимеров[27].

[4+1]-Циклоприсоединение

Клик-реакция изонитрилов представляет собой [4+1]-циклоприсоединение, за которым следует ретрореакция Дильса-Альдера с выделением N2.[11] По данной причине реакция является необратимой. Продукт устойчив в том случае, если используется третичный изонитрил. В случае первичных и вторичных изонитрилов образуется имин, который затем быстро гидролизуется (на схеме изображено красным цветом).

Изонитрил является хорошей биоортогональной группой благодаря маленькому размеру, стабильности, нетоксичности и отсутствию в биологических системах. Однако, реакция [4+1]-циклоприсоединения протекает медленно с константой скорости второго порядка, равной 10−2 М−1 с−1.

4plus1mech.png

Фотоклик-реакция тетразола

Тетразол может подвергаться фотоиндуцированной реакции циклоэлиминирования с выделением азота. При этом образуется короткоживущий 1,3-диполь, вступающий в 1,3-диполярное циклоприсоединение с алкенами, давая циклопиразолиновые аддукты.[28]

Photoclick.png

Фотоиндукция протекает при кратковременном облучении светом (длина волны зависит от тетразола), чтобы снизить наносимый светом ущерб клеткам. Реакция ускоряется в водной среде и даёт единственный региоизомер. Достоинства такого подхода заключаются в возможности пространственного и временного контроля за реакцией, а также в возможности ввести алкены или тетразолы в биомолекулы с использованием простых биологических методов. Кроме того, создан флуорогенный тетразол, позволяющий следить за степенью протекания реакции во времени.[29]

Квадрициклановое лигирование

В ходе квадрицикланового лигирования напряженный квадрициклан вступает в [2+2+2]-циклоприсоединение с π-системами. Квадрициклан не встречается в нативных биомолекулах, не реагирует с ними (из-за насыщенности молекулы), обладает относительно малым размером и сильным напряжением (~80 ккал/моль). Тем не менее, он очень стабилен при комнатной температуре и в водной среде при физиологическом рН. Он способен селективно реагировать с электронодефицитными π-системами, но не с простыми алкенами, алкинами или циклооктинами.[4]

Quadmech.png

Бис(дитиобензил)никель(II) был выбран в качестве второго реагента в результате скрининга на реакционную способность. Для того, чтобы предотвратить фотоиндуцированную инверсию в норборнадиен, в реакцию добавляют диэтилдитиокарбамат, хелатирующий никель в образующемся продукте.

Реакция протекает с константой скорости второго порядка, равной 0,25 М−1 с−1 (в водной среде). Была показана её ортогональность как к реакции образования оксима, так и к безмедному азид-алкиновому циклоприсоединению.

Примечания

  1. Sletten E. M., Bertozzi C. R. Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality (англ.) // Angew. Chem. Int. Ed. — 2009. — Т. 48. — № 38. — С. 6974–6998. — DOI:10.1002/anie.200900942 — PMID 19714693.
  2. Prescher J. A., Dube D. H., Bertozzi C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals (англ.) // Nature. — 2004. — Т. 430. — С. 873–877. — DOI:10.1038/nature02791 — PMID 15318217.
  3. Prescher J. A., Bertozzi C. R. Chemistry in living systems (англ.) // Nature Chemical Biology. — 2005. — Т. 1. — № 1. — С. 13–21. — DOI:10.1038/nchembio0605-13 — PMID 16407987.
  4. 1 2 3 4 Sletten E. M., Bertozzi C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions (англ.) // Acc. Chem. Res. — 2011. — Т. 44. — № 9. — С. 666–676. — DOI:10.1021/ar200148z — PMID 21838330.
  5. Plass T., Milles S., Koehler C., Schultz C., Lemke E. A. Genetically Encoded Copper-Free Click Chemistry (англ.) // Angew. Chem. Int. Ed. — 2011. — Т. 50. — № 17. — С. 3878–3881. — DOI:10.1002/anie.201008178 — PMID 21433234.
  6. Neef A. B., Schultz C. Selective Fluorescence Labeling of Lipids in Living Cells (англ.) // Angew. Chem. Int. Ed. — 2009. — Т. 48. — № 8. — С. 1498–1500. — DOI:10.1002/anie.200805507 — PMID 19145623.
  7. Baskin J. M., Prescher J. A., Laughlin S. T., Agard N. J., Chang P. V., Miller I. A., Lo A., Codelli J. A., Bertozzi C. R. Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging (англ.) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2007. — Т. 104. — № 43. — С. 16793–16797. — DOI:10.1073/pnas.0707090104 — PMID 17942682.
  8. 1 2 Ning X., Temming R. P., Dommerholt J., Guo J., Ania D. B., Debets M. F., Wolfert M. A., Boons G.-J., van Delft F. L. Protein Modification by Strain-Promoted Alkyne–Nitrone Cycloaddition (англ.) // Angew. Chem. Int. Ed. — 2010. — Т. 49. — № 17. — С. 3065–3068. — DOI:10.1002/anie.201000408 — PMID 20333639.
  9. Yarema K. J., Mahal L. K., Bruehl R. E., Rodriguez E. C., Bertozzi C. R. Metabolic Delivery of Ketone Groups to Sialic Acid Residues. APPLICATION TO CELL SURFACE GLYCOFORM ENGINEERING (англ.) // J. Biol. Chem. — 1998. — Т. 273. — № 47. — С. 31168–31179. — DOI:10.1074/jbc.273.47.31168 — PMID 9813021.
  10. Blackman M. L., Royzen M., Fox J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2008. — Т. 130. — № 41. — С. 13518–13519. — DOI:10.1021/ja8053805 — PMID 18798613.
  11. 1 2 Stöckmann H., Neves A. A., Stairs S., Brindle K. M., Leeper F. J. Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation with biomolecules (англ.) // Org. Biomol. Chem. — 2011. — Т. 9. — № 21. — С. 7303–7305. — DOI:10.1039/C1OB06424J — PMID 21915395.
  12. Sletten E. M., Bertozzi C. R. A Bioorthogonal Quadricyclane Ligation (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2011. — Т. 133. — № 44. — С. 17570–17573. — DOI:10.1021/ja2072934 — PMID 21962173.
  13. Saxon E., Bertozzi C. R. Cell Surface Engineering by a Modified Staudinger Reaction (англ.) // Science. — 2000. — Т. 287. — № 5460. — С. 2007–2010. — DOI:10.1126/science.287.5460.2007 — PMID 10720325.
  14. Lin F. L., Hoyt H. M., van Halbeek H., Bergman R. G., Bertozzi C. R. Mechanistic Investigation of the Staudinger Ligation (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2005. — Т. 127. — № 8. — С. 2686–2695. — DOI:10.1021/ja044461m — PMID 15725026.
  15. Hangauer M. J., Bertozzi C. R. A FRET-Based Fluorogenic Phosphine for Live-Cell Imaging with the Staudinger Ligation (англ.) // Angew. Chem. Int. Ed. — 2008. — Т. 47. — № 13. — С. 2394–2397. — DOI:10.1002/anie.200704847
  16. Lemieux G. A., de Graffenried C. L., Bertozzi C. R. A Fluorogenic Dye Activated by the Staudinger Ligation (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2003. — Т. 125. — № 16. — С. 4708–4709. — DOI:10.1021/ja029013y — PMID 12696879.
  17. Kennedy D. C., McKay C. S., Legault M. C. B., Danielson D. C., Blake J. A., Pegoraro A. F., Stolow A., Mester Z., Pezacki J. P. Cellular Consequences of Copper Complexes Used To Catalyze Bioorthogonal Click Reactions (ут) // J. Am. Chem. Soc. — 2011. — Т. 133. — № 44. — С. 17993–18001. — DOI:10.1021/ja2083027 — PMID 21970470.
  18. Huisgen R. 1,3-Dipolar cycloadditions. 76. Concerted nature of 1,3-dipolar cycloadditions and the question of diradical intermediates (англ.) // J. Org. Chem. — 1976. — Т. 41. — № 3. — С. 403–419. — DOI:10.1021/jo00865a001
  19. Schoenebeck F., Ess D. H., Jones G. O., Houk K. N. Reactivity and Regioselectivity in 1,3-Dipolar Cycloadditions of Azides to Strained Alkynes and Alkenes: A Computational Study (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2009. — Т. 131. — № 23. — С. 8121–8133. — DOI:10.1021/ja9003624 — PMID 19459632.
  20. Gold B., Shevchenko N. E., Bonus N., Dudley G. B., Alabugin I. V. Selective Transition State Stabilization via Hyperconjugative and Conjugative Assistance: Stereoelectronic Concept for Copper-Free Click Chemistry (англ.) // J. Org. Chem. — 2012. — Т. 77. — № 1. — С. 75–89. — DOI:10.1021/jo201434w — PMID 22077877.
  21. Gutsmiedl K., Wirges C. T., Ehmke V., Carell T. Copper-Free “Click” Modification of DNA via Nitrile Oxide−Norbornene 1,3-Dipolar Cycloaddition (англ.) // Org. Lett. — 2009. — Т. 11. — № 11. — С. 2405–2408. — DOI:10.1021/ol9005322 — PMID 19405510.
  22. van Berkel S. S., Dirks A. J., Debets M. F., van Delft F. L., Cornelissen J. J. L. M., Nolte R. J. M., Rutjes F. P. J. T. Metal-Free Triazole Formation as a Tool for Bioconjugation (англ.) // ChemBioChem. — 2007. — Т. 8. — № 13. — С. 1504–1508. — DOI:10.1002/cbic.200700278 — PMID 17631666.
  23. van Berkel S. S., Dirks A. J., Meeuwissen S. A., Pingen D. L. L., Boerman O. C., Laverman P., van Delft F. L., Cornelissen J. J. L. M., Rutjes F. P. J. T. Application of Metal-Free Triazole Formation in the Synthesis of Cyclic RGD–DTPA Conjugates (англ.) // ChemBioChem. — 2008. — Т. 9. — № 11. — С. 1805–1815. — DOI:10.1002/cbic.200800074 — PMID 18623291.
  24. Bach R. D. Ring Strain Energy in the Cyclooctyl System. The Effect of Strain Energy on [3 + 2] Cycloaddition Reactions with Azides (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2009. — Т. 131. — № 14. — С. 5233–5243. — DOI:10.1021/ja8094137 — PMID 19301865.
  25. Blackman M. L., Royzen M., Fox J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2008. — Т. 130. — № 41. — С. 13518–13519. — DOI:10.1021/ja8053805
  26. Devaraj N. K., Ralph Weissleder R., Hilderbrand S. A. Tetrazine-Based Cycloadditions: Application to Pretargeted Live Cell Imaging (англ.) // Bioconjugate Chem. — 2008. — Т. 19. — № 12. — С. 2297–2299. — DOI:10.1021/bc8004446 — PMID 19053305.
  27. Hansell C. F., Espeel P., Stamenović M. M., Barker I. A., Dove A. P., Du Prez F. E., O’Reilly R. K. Additive-Free Clicking for Polymer Functionalization and Coupling by Tetrazine–Norbornene Chemistry (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2011. — Т. 133. — № 35. — С. 13828–13831. — DOI:10.1021/ja203957h — PMID 21819063.
  28. Lim R. K. V., Lin Q. Photoinducible Bioorthogonal Chemistry: A Spatiotemporally Controllable Tool to Visualize and Perturb Proteins in Live Cells (англ.) // Acc. Chem. Res. — 2011. — Т. 44. — № 9. — С. 828–839. — DOI:10.1021/ar200021p — PMID 21609129.
  29. Song W., Wang Y., Qu J.,Lin Q. Selective Functionalization of a Genetically Encoded Alkene-Containing Protein via “Photoclick Chemistry” in Bacterial Cells (англ.) // J. Am. Chem. Soc. — 2008. — Т. 130. — № 30. — С. 9654–9655. — DOI:10.1021/ja803598e — PMID 18593155.

Wikimedia Foundation. 2010.


Поделиться ссылкой на выделенное

Прямая ссылка:
Нажмите правой клавишей мыши и выберите «Копировать ссылку»

We are using cookies for the best presentation of our site. Continuing to use this site, you agree with this.