Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением


Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX — «Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment») — процесс создания олигонуклеотидов одноцепочечной ДНК или РНК путем итерационного обогащения смеси олигонуклеотидов согласно их способности связываться с мишенью. Такие олигонуклеотиды называются аптамерами.

Синтез аптамеров

Аптамеры содержат три участка — два константных с обоих концов последовательности, содержащие промотор, сайты рестрикции, а также участки связывания праймеров для ПЦР, а также рандомизированный участок, который может быть получен двумя способами:

  1. химического синтеза — в случаях, когда ничего не известно об особенностях связывания аптамеров с лигандами
  2. тонкой подгонки уже существующей РНК (ДНК) — для этого вводят случайные мутации в известную последовательность при химическом синтезе

Процесс

Процесс создания аптамеров на основе РНК начинается с синтеза большой количества рандомных последовательностей ДНК (библиотеки). Далее библиотека амплифицируется посредством ПЦР и транскрибируется, в результате чего образуется мРНК, которая сворачивается специфическим образом и связывается с лигандом. Несвязавшиеся молекулы олигонуклеотидов отмывают, затем элюируют связавшиеся для синтеза молекул ДНК обратной транскипцией. Затем получившиеся молекулы амплифицируют и проводят новый цикл.

Цикл повторяют от 5 до 10 раз в зависимости от длины рандомного участка. При этом первые несколько циклов проходят в мягких условиях для отбора только связывающихся молекул (в том числе, неспецифически), затем увеличивают жесткость селекции уменьшением лиганда, времени связывания, а также увеличения количества молекул олигонуклеотидов.



Wikimedia Foundation. 2010.