- PBR322
-
Карта плазмиды pBR 322
pBR322 — плазмида, используемая в бактериях E. coli как вектор клонирования. Создана в 1977 году мексиканскими биологами Франциско Боливаром (англ.)русск. и Раймондом Родригесом[1].
pBR322 содержит 4361 нуклеотидную пару[2] и состоит из участка репликации ori (взят из плазмиды pMB1 (англ.)русск.); гена ampR, кодирующего белок, обеспечивающий устойчивость к ампициллину (взят из плазмиды RSF2124 (англ.)русск.) и гена tetR, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину (взят из плазмиды pSC101 (англ.)русск.). Плазмида содержит уникальные сайты рестрикции для более чем 40 рестриктаз. 11 из этих 40 сайтов находятся внутри гена tetR, причём 2 сайта (HindIII (англ.)русск. и ClaI (англ.)русск.) расположены внутри промотора этого гена. 6 сайтов находятся внутри гена ampR. Участок репликации ori (англ.)русск., заимствованный из плазмиды pMB1, сходен по структуре с ColE1[3]. Он кодирует две РНК (RNAI и RNAII) и один белок (Rom или Rop).
Молекулярная масса плазмиды составляет 2,83·106 дальтон[4].
Код в базе данных GenBank — J01749[5].
Нумерацию нуклеотидных пар принято начинать с центральной линии уникального сайта рестрикции EcoRI в направлении гена tet. Ген устойчивости к ампициллину – пенициллиновая бета-лактамаза (англ. penicillin beta-lactamase) с промотерами P1 и P3. P3 является естественным промотором, а P1 создан искусственно лигированием двух различных фрагментов ДНК. Промотер P2 аналогичен P1, однако расположен на противоположной стороне плазмиды и инициирует транскрипцию в направлении гена устойчивости к тетрациклину[5].
Содержание
История создания
В 1975 году, когда Франциско Боливар (англ.)русск. начал работу в Калифорнийском университете в Сан-Франциско в составе группы Герберта Бойера (англ.)русск., инструментарий, имевшийся в распоряжении молекулярных биологов, был крайне беден. Векторы клонирования имели очень большую молекулярную массу, их свойства были плохо изучены, удобные сайты клонирования отсутствовали[6].
Группа Бойера, в состав которой входило несколько талантливых биологов, занималась клонированием и изучением некоторых специфических генов. Однако работа продвигалась крайне медленно из-за отсутствия удобных инструментов, в первую очередь векторов клонирования, а также достаточно чистых эндонуклеаз рестрикции и ДНК-лигазы Т4. Со временем некоторые члены группы пришли к мысли о создании более совершенного инструментария.
В первое время Бойер не одобрял занятий своих сослуживцев, и большую часть работы пришлось проделать в нерабочее время. Однако когда плазмида pBR322 была создана, он стал активным сторонником и пропагандистом нового инструмента, заменив им использовавшуюся ранее плазмиду pMB9. Новая плазмида быстро распространилась по научному сообществу, в течение первых дней её получили более 300 лабораторий по всему миру. Оригинальный метод клонирования путём деактивации генов сопротивляемости к антибиотикам позволял легко планировать эксперименты и быстро анализировать полученные данные.
В то время проблемы биологической безопасности считалась чрезвычайно актуальными, поэтому плазмида была создана с сильно ограниченными возможностями распространения за пределами лаборатории. Она стала первым вектором типа EK2, сертифицированная Национальным институтом зоровья (англ.)русск. как соответствующая требованиям безопасности для рекомбинантных ДНК.
Наконец, очень сильно способствовало популярности новой плазмиды расшифровка и опубликование в 1979 году её нуклеотидной последовательности, сделанное Грегом Сатклиффом (англ. Greg Sutcliffe) из лаборатории Уолтера Гилберта[7].
В течение десятилетий pBR322 активно использовалась в генных исследованиях. Её кодовая последовательность и функции генов были настолько хорошо изучены, что стали использоваться как компоненты при создании новых инструментальных плазмид.
Оригинальная статья в журнале Gene[1], где было описано создание плазмиды, стала одним из лидеров по числу цитирований среди статей по молекулярной биологии в 1970-х и начале 1980-х годов[8].
Структура плазмиды
Нуклеотидная последовательность
Нуклеотидная последовательность pBR322 следующая[5]
pBR322 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATCC TCTACGCCGG ACGCATCGTG GCCGGCATCA CCGGCGCCAC 421 AGGTGCGGTT GCTGGCGCCT ATATCGCCGA CATCACCGAT GGGGAAGATC GGGCTCGCCA 481 CTTCGGGCTC ATGAGCGCTT GTTTCGGCGT GGGTATGGTG GCAGGCCCCG TGGCCGGGGG 541 ACTGTTGGGC GCCATCTCCT TGCATGCACC ATTCCTTGCG GCGGCGGTGC TCAACGGCCT 601 CAACCTACTA CTGGGCTGCT TCCTAATGCA GGAGTCGCAT AAGGGAGAGC GTCGACCGAT 661 GCCCTTGAGA GCCTTCAACC CAGTCAGCTC CTTCCGGTGG GCGCGGGGCA TGACTATCGT 721 CGCCGCACTT ATGACTGTCT TCTTTATCAT GCAACTCGTA GGACAGGTGC CGGCAGCGCT 781 CTGGGTCATT TTCGGCGAGG ACCGCTTTCG CTGGAGCGCG ACGATGATCG GCCTGTCGCT 841 TGCGGTATTC GGAATCTTGC ACGCCCTCGC TCAAGCCTTC GTCACTGGTC CCGCCACCAA 901 ACGTTTCGGC GAGAAGCAGG CCATTATCGC CGGCATGGCG GCCGACGCGC TGGGCTACGT 961 CTTGCTGGCG TTCGCGACGC GAGGCTGGAT GGCCTTCCCC ATTATGATTC TTCTCGCTTC 1021 CGGCGGCATC GGGATGCCCG CGTTGCAGGC CATGCTGTCC AGGCAGGTAG ATGACGACCA 1081 TCAGGGACAG CTTCAAGGAT CGCTCGCGGC TCTTACCAGC CTAACTTCGA TCACTGGACC 1141 GCTGATCGTC ACGGCGATTT ATGCCGCCTC GGCGAGCACA TGGAACGGGT TGGCATGGAT 1201 TGTAGGCGCC GCCCTATACC TTGTCTGCCT CCCCGCGTTG CGTCGCGGTG CATGGAGCCG 1261 GGCCACCTCG ACCTGAATGG AAGCCGGCGG CACCTCGCTA ACGGATTCAC CACTCCAAGA 1321 ATTGGAGCCA ATCAATTCTT GCGGAGAACT GTGAATGCGC AAACCAACCC TTGGCAGAAC 1381 ATATCCATCG CGTCCGCCAT CTCCAGCAGC CGCACGCGGC GCATCTCGGG CAGCGTTGGG 1441 TCCTGGCCAC GGGTGCGCAT GATCGTGCTC CTGTCGTTGA GGACCCGGCT AGGCTGGCGG 1501 GGTTGCCTTA CTGGTTAGCA GAATGAATCA CCGATACGCG AGCGAACGTG AAGCGACTGC 1561 TGCTGCAAAA CGTCTGCGAC CTGAGCAACA ACATGAATGG TCTTCGGTTT CCGTGTTTCG 1621 TAAAGTCTGG AAACGCGGAA GTCAGCGCCC TGCACCATTA TGTTCCGGAT CTGCATCGCA 1681 GGATGCTGCT GGCTACCCTG TGGAACACCT ACATCTGTAT TAACGAAGCG CTGGCATTGA 1741 CCCTGAGTGA TTTTTCTCTG GTCCCGCCGC ATCCATACCG CCAGTTGTTT ACCCTCACAA 1801 CGTTCCAGTA ACCGGGCATG TTCATCATCA GTAACCCGTA TCGTGAGCAT CCTCTCTCGT 1861 TTCATCGGTA TCATTACCCC CATGAACAGA AATCCCCCTT ACACGGAGGC ATCAGTGACC 1921 AAACAGGAAA AAACCGCCCT TAACATGGCC CGCTTTATCA GAAGCCAGAC ATTAACGCTT 1981 CTGGAGAAAC TCAACGAGCT GGACGCGGAT GAACAGGCAG ACATCTGTGA ATCGCTTCAC 2041 GACCACGCTG ATGAGCTTTA CCGCAGCTGC CTCGCGCGTT TCGGTGATGA CGGTGAAAAC 2101 CTCTGACACA TGCAGCTCCC GGAGACGGTC ACAGCTTGTC TGTAAGCGGA TGCCGGGAGC 2161 AGACAAGCCC GTCAGGGCGC GTCAGCGGGT GTTGGCGGGT GTCGGGGCGC AGCCATGACC 2221 CAGTCACGTA GCGATAGCGG AGTGTATACT GGCTTAACTA TGCGGCATCA GAGCAGATTG 2281 TACTGAGAGT GCACCATATG CGGTGTGAAA TACCGCACAG ATGCGTAAGG AGAAAATACC 2341 GCATCAGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC 2401 GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA 2461 ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG 2521 CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT 2581 CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA 2641 GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC 2701 TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCATA GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT 2761 AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG 2821 CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG 2881 CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT 2941 TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC 3001 TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG 3061 CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC 3121 AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT 3181 AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA 3241 AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT 3301 GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT 3361 GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG 3421 CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG 3481 CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA 3541 ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG 3601 CCATTGCTGC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG 3661 GTTCCCAACG ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT 3721 CCTTCGGTCC TCCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA 3781 TGGCAGCACT GCATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG 3841 GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC 3901 CGGCGTCAAC ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG 3961 GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA 4021 TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG 4081 GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT 4141 GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC 4201 TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA 4261 CATTTCCCCG AAAAGTGCCA CCTGACGTCT AAGAAACCAT TATTATCATG ACATTAACCT 4321 ATAAAAATAG GCGTATCACG AGGCCCTTTC GTCTTCAAGA AГены
Источник информации[9].
Ген Нуклеотидная
последовательностьИсточник Примечание tet (TcR) 86—1276 pSC101 Устойчивость к тетрациклину bla (ApR) 4153—3293 Tn3 Устойчивость к ампициллину rop 1915—2106 pMB1 Белок Rop ori 3122—2534 pMB1 Участок репликации Сайты рестрикции
Жирным шрифтом выделены уникальные сайты[9].
По координатам По алфавиту Сайт Координата Ген Сайт Координата Ген ClaI-BspDI 23 AatII-ZraI 4284 HindIII 29 AcuI 3000 ori EcoRV 185 tet AcuI 4048 amp BmtI-NheI 229 tet AhdI 3361 amp BamHI 375 tet AlwNI 2884 ori SgrAI 409 tet AseI 3537 amp BanII 471 tet AvaI-BsoBI 1425 BanII 485 tet BamHI 375 tet BtgI 528 tet BanII 471 tet SphI 562 tet BanII 485 tet EcoNI 622 tet BciVI 2682 ori SalI-AccI-HincII 651 tet BciVI 4209 PshAI 712 tet BmtI-NheI 229 tet EagI 939 tet BsaAI 2225 BseYI 949 tet BsaBI 1668 NruI 972 tet BsaI 3433 amp BstAPI 1045 tet BseYI 949 tet BspMI-BfuAI 1063 tet BseYI 2777 ori PflMI 1315 BsgI 1650 BsmI 1353 BsmBI 2122 PflMI 1364 BsmI 1353 StyI 1369 BspEI 1664 AvaI-BsoBI 1425 BspMI-BfuAI 1063 tet PpuMI 1438 BspQI-SapI 2350 MscI 1444 BsrBI 2404 BtgI 1447 BsrBI 4205 PpuMI 1480 BsrDI 3420 amp BsgI 1650 BsrDI 3602 amp BspEI 1664 BstAPI 1045 tet BsaBI 1668 BstAPI 2291 XmnI 2029 rop BstZ17I-AccI 2244 PvuII 2064 rop BtgI 528 tet BsmBI 2122 BtgI 1447 DrdI 2162 BtsI 3759 amp Tth111I-PflFI 2217 BtsI 3787 amp BsaAI 2225 ClaI-BspDI 23 BstZ17I-AccI 2244 DrdI 2162 BstAPI 2291 DrdI 2575 ori NdeI 2295 EagI 939 tet BspQI-SapI 2350 EarI 2351 EarI 2351 EarI 4155 BsrBI 2404 EcoNI 622 tet PciI-AflIII 2473 EcoRI 4359 DrdI 2575 ori EcoRV 185 tet BciVI 2682 ori HincII 3905 amp BseYI 2777 ori HindIII 29 AlwNI 2884 ori MscI 1444 AcuI 3000 ori NdeI 2295 AhdI 3361 amp NruI 972 tet BsrDI 3420 amp PciI-AflIII 2473 BsaI 3433 amp PflMI 1315 AseI 3537 amp PflMI 1364 BsrDI 3602 amp PpuMI 1438 PstI 3607 amp PpuMI 1480 PvuI 3733 amp PshAI 712 tet BtsI 3759 amp PstI 3607 amp BtsI 3787 amp PvuI 3733 amp ScaI 3844 amp PvuII 2064 rop HincII 3905 amp SalI-AccI-HincII 651 tet XmnI 3961 amp ScaI 3844 amp AcuI 4048 amp SgrAI 409 tet EarI 4155 SphI 562 tet SspI 4168 SspI 4168 BsrBI 4205 StyI 1369 BciVI 4209 Tth111I-PflFI 2217 AatII-ZraI 4284 XmnI 2029 rop EcoRI 4359 XmnI 3961 amp Плазмида pBR322 в массовой культуре
По сюжету романа Майкла Крайтона «Парк юрского периода» части плазмиды pBR322 используются для воссоздания ДНК динозавров[10]. Хотя само название плазмиды не упоминается на страницах книги, там приводится последовательность нуклеотидов, являющаяся по сюжету фрагментом восстановленной ДНК динозавра. Поиск в базе данных GenBank при помощи поисковой программы BLASTN находит большое количество совпадений с генной последовательностью pBR322.
См. также
Ссылки
- Overview
- ETHZ/Biology/Lab
- Restriction Maps. pBR322.
- Bacterial Vectors >> pBR 322 Plasmids.
- J. Gregor Sutcliffe (December 17, 1990). «The Sequence of pBR322». Current Contents 51: 22.
Примечания
- ↑ 1 2 Bolivar F., Rodriguez R.L., Greene P.J., Betlach M.C., Heyneker H.L., Boyer H.W., Crosa J.H., Falkow S. (1977). «Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system». Gene 2 (2): 95-113. PMID 344137.
- ↑ Watson, N. (1988). «A new revision of the sequence of plasmid pBR322». Gene 70 (2): 399–403. DOI:10.1016/0378-1119(88)90212-0. PMID 3063608. Проверено 2009-03-27.
- ↑ Qiagen Plasmid Resource Center Growth of Bacterial Cultures.(недоступная ссылка — история)
- ↑ pBR322 Vector.
- ↑ 1 2 3 pBR322 Nucleotide Sequences, NCBI Sequence Viewer v2.0.
- ↑ Все материалы данного раздела, кроме абзацев, где источник указан особо, взяты из статьи Francisco Bolivar Zapata (November 19, 1990). «Multipurpose Tools in Molecular Biology». Current Contents 47: 12.
- ↑ Sutcliffe J. G. (1979) Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43: 77—80, PMID: 383387.
- ↑ Garfield E. (1 October 1984) The articles most cited in 1961-1982. 4. 100 additional Citation Classics. Current Contents, 40: 3—9.
- ↑ 1 2 Restriction Maps. pBR322.
- ↑ Mark Boguski (1992). «A Molecular Biologist Visits Jurassic Park». Biotechniques 12: 668–9. Проверено 2009-03-27.
Категория:- Генетическая инженерия
Wikimedia Foundation. 2010.
