Allium test


Allium test

Содержание

Silk-film.png Внешние видеофайлы
Allium test
(Ознакомьтесь с наглядным материалом)
Silk-film.png
Атлас мутаций[1]скачать посмотреть

на сайте журнала Радиоэлектроника

Allium test — растительная тест система для оценки мутагенного, митозмодифицирующего и токсического эффектов факторов химической и физической природы на основе растения Allium cepaЛук репчатый (сорт Штутгартен).

В Allium test используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa, который впервые предложен Шведской Королевской Академией Наук как стандартный тест-объект [2][3].

В современных исследованиях Allium cepa L. считается эталонным растительным тест-объектом для анализа мутагенности, митотоксичности и токсичности различных факторов [2][4]. Наряду с Allium test используются и другие тест-объекты (среди растений наиболее часто — горох Pisum sativum и бобы Vicia faba).

Данный метод является простым, экономичным, краткосрочным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор, "цитотоксичен" или "не цитотоксичен". [5]. Allium test рекомендован для исследования практически любых химических, физических и биологических факторов. По мере синтеза новых веществ, тест получает новые рекомендации, что делает его одним из наиболее популярных.

Allium test рекомендован экспертами ВОЗ как стандарт в цитогенетическом мониторинге окружающей среды, так как результаты, полученные на данном тесте, показывают корреляцию с тестами на других организмах: водорослях, растениях, насекомых, в том числе и млекопитающих и человеке[3][6][7][8][9]. Рекомендован в качестве альтернативы генотоксикологическим тестам на лабораторных животных (в том случае если для одних и тех же исследуемых веществ наблюдается одинаковый результат в данном тесте и тестах на животных, то есть если показана корреляция)[10]

История метода «Allium Test», преимущества перед другими методами и перспективы

История биотеста Allium test началась более 70 лет назад. Тест был разработан А. Леваном в 1938 году для изучения эффекта влияния колхицина на митоз в клетках Allium cepa, и в итоге показавший высокую эффективность. Этому предшествовали работы Генри Шаффнера, которые были опубликованы в 1894—1898 гг., и посвящены выяснению цитоструктуры и митозу в корневых меристемах у Allium cepa.[11][12].
В настоящее время термин Allium test используется наряду с постоянно увеличивающимся числом объектов и при этом продолжает оставаться одним из наилучших тест-объектов для анализа генотоксичности различных факторов. После А. Левана разработкой биотестирования с помощью лука обыкновенного занимался шведский ученый Dr. Geirid Fiskesjo в 80-х годах. Вот его собственная оценка данного метода:

  • Растения легки для хранения и ухода, широко распространены и недорогие. Вообще, состояние хромосомы клеток растения — хорошее, поэтому обеспечивает высокое качество в контрольных условиях.
  • Биотест Allium cepa является относительно быстрым, легким для выполнения испытанй, а также высокочувствительным и воспроизводимым. Это также обеспечивает сходимые результаты с целым рядом других тестовых систем.
  • Как макроскопический, так и микроскопический эффекты, обладают хорошей корреляцией между собой. Макроскопический эффект (сдерживание корневого прироста) является самым чувствительным параметром. Сдерживание прироста является следствием прямых или косвенных вредных эффектов. Микроскопическое исследование позволяет оценить повреждения хромосом и нарушения деления клеток, и поэтому обеспечивает дополнительную информацию относительно остроты, механизма генотоксического эффекта или потенциальной мутагенности.
  • Корневые клетки обладают определенными ферментами, выполняющими функции оксидаз, которые способствуют превращению многих не мутагенных веществ в мутагенные. Эта система активации позволяет обнаружить те химические вещества, которые усиливают свой токсический эффект в процессе метаболизма.
  • Система имеет широкий ряд применений, например, для проверки химической чистоты питьевой, природной воды, а также промышленного ущерба и т. п., и полезен для оценки и классификации экологических химикатов с ссылкой на токсичность.
  • Биотест может также использоваться для измерения относительной токсичности нерастворимых в воде соединений, при условии, что они могут быть растворены в подходящем растворителе, а затем разбавлены в воде таким образом, что остаточная концентрация не превысит определенных пределов. В таких случаях для контроля растворителей должен также быть организован тестовый режим. биотест действует над широким рядом pH (3,5 — 11,0) без каких-нибудь очевидных эффектов на приросте корневых систем. Поэтому умеренно кислые/щелочные образцы воды, химические растворы, и т. п. могут быть исследованы без необходимой корректировки pH.
  • Биотест с использованием Allium cepa высокочувствителен и может дать позитивные токсические эффекты в случаях, когда исследуемые пробы проверены в других системах (особенно высшие организмы, как например рыбы) и по их результатам не токсичны. Позитивные результаты в этой тестовой системе указывают потенциальный биологический риск. Экстраполяция результатов от одной тестовой системы к другой (и в конечном счете к человеку) должна быть основанной на результатах серии испытаний и с должным рассмотрением к метаболическим превращениям тестируемого образца.
  • В сравнении с другими краткосрочным альтернативным биотестами на токсичность этот тест показал хорошую сходимость с результатами других тестовых систем, использующих множество других организмов, как эукариотов, так и прокариотов. Результаты таких сравнений описаны ниже[3]:
  • В кольцевом тесте, где для изучения веществ использовались в качестве тест систем различные микроорганизмы независимыми лабораториями, те же самые вещества были предложены для тестирования и на Allium test-e. Среди этих микроорганизмов 16 различных морских водорослях (зеленые морские водоросли и кремневые морские водоросли), дрожжах (Saccharomyces cerevisiae), простейших (Tetrahymena pyriformis) и микроорганизмы активного ила(сообщество бактерий, дрожжей и простейших). Результаты были в целом хорошо сравнимы, хотя были видимы некоторые отличия в чувствительности. Большинство морских водорослей были чувствительнее, чем Allium сера, тогда как дрожжи, простейшие и тест на активном иле были менее чувствительны.
  • Целый ряд водных растений и животных оказался менее чувствительным к определенным классам веществ сравнению с биотестом Allium например рыбы (Gasterosteus aculeatus), водные животные (Daphnia magna, Brachydario rerio — яйца или икра бактерии Microtox) и растения (одноклеточные морские водоросли). Другие животные (например. Nitocra spinipes) и растения (напр. морские водоросли и одноклеточные) представляют сопоставимые результаты рассматриваемому биотесту
  • В исследованиях на бензопирен китайская система с использованием клеток хомяка V79 без учёта метаболических эффектов системы активизации являются менее чувствительными, чем Allium сера. Относительная чувствительность меняется с учётом влияния функций оксидаз. Несмотря на изменения в чувствительности общие результаты между двумя системами сравнимы.
  • Испытания, проведенные на человеческих лимфоцитах, которые оказались немного более чувствительными к эффектам органических ртутных соединений, чем клетки меристемы корней Allium cepa, в целом однотипны. Нужно также отметить, что изучение микроскопических параметров обоих клеток дают подобный эффект (c-митоз).
  • Биотестирование с помощью Allium сера, в данном случае, является лучшим методом определения экологического риска за счет его высокой чувствительности.

Преимущества метода Allium cepa

Преимущества растительной тест-системы Allium cepa. Преимущества Allium test перед другими методами

Данный метод не требует знания кариотипа и идентификации типов повреждений хромосом, является простым, экономичным и достаточно чувствительным для определения «мутаген» или «не мутаген» фактор[5].

Метод позволяет регистрировать хромосомные мутации типа делеций и транслокаций, следствием которых является наличие мостов и фрагментов в ана- и телофазе. Метод позволяет выявлять изменение поведения хромосом на веретене деления[5]. Allium test идеально подходит для проведения микроядерного теста.

  • Известный и распространенный тест Эймса по чувствительности и достоверности результатов значительно уступает Allium test при оценке загрязнений [13]. Кроме того Allium test был рекомендован для тестирования образцов различных наноматериалов, тогда как тест Эймса оказался неприемлемы, в связи с ложноотрицательными результатами [14].
  • Исследование мутагенных свойств наночастиц диоксида титана на корневых меристемах Allium cepa и лимфоцитах человека показало, что оба теста проявляют сходную чувствительность к данному веществу [15].
  • При изучении генотоксического потенциала соединений никеля было показано, что Allium test также высокочувствителен к ним, как лимфоциты и фибробласты человека [16].

Преимущества растительных тест систем на примере лука Allium cepa

Растительные тест-системы в настоящее время получают всё большее распространение при оценке мутагенного загрязнения окружающей среды. Это обусловлено целым рядом преимуществ растений как индикаторов генотоксичности различных факторов, так и сигнальных объектов при генетическом мониторинге за состоянием окружающей среды:

  • Растения — неизменный объект для натурных исследований антропогенного влияния на окружающую среду: первыми принимают на себя удар загрязнителей, не мигрируют подобно животным, что позволяет чётко рассчитать время воздействия.
  • Растения — эукариотические организмы, поэтому на них, в отличие от микроорганизмов, можно регистрировать все типы генетических повреждений:
  • генные,
  • хромосомные,
  • геномные.
  • Методы работы с растительными объектами экономичны, требуют минимального количества оборудования и реактивов, выращивание растений менее трудоёмко, чем выращивание животных[17].
  • Можно получать материал нужных стадий.
  • Эксперименты можно вести в строго контролируемых условиях — как в острых, так и в хронических опытах (от нескольких часов до нескольких лет).
  • Данные по мутагенезу ряда факторов на растительных объектах показывают хорошую корреляцию с результатами тестирования на животных.
  • Растения позволяют регистрировать как прямые, так и косвенные мутагены.
  • Только растения позволяют выявить такой важный класс мутагенов, как химические соединения, приобретающие мутагенность в процессе метаболической активации растительными ферментами.
  • Некоторые факторы, высокая токсичность которых не позволяет учесть генетические повреждения на животных, могут быть оценены как мутагены только в растительных тест-системах.
  • Растения могут выращиваться непосредственно на месте оценки суммарного генетического эффекта загрязнения определяемых участков[18].
  • Данные полученные на растительных тест-системах показывают хорошую корреляцию с данными тестов на млекопитающих. Более того, высшие растения проявляют себя в экосистеме как стабильный биосенсор и, таким образом позволяют отследить эволюцию генотоксического воздействия (в том случае когда фактор проявляет мутагенный эффект одновременно на растительном и животном тест объектах)[19].

Характеристика лука Allium cepa L., применимость в тестах

Allium cepa L. (отдел Angiospermae, класс Liliopsida, подкласс Lilidae, порядок Liliales, семейство Alliaceae, род Allium L.) в качестве тест объекта широко применяется для оценки генетического потенциала химических соединений, природных и сточных вод[4]. Лук имеет 16 хорошо прокрашиваемых хромосом (2n=16)[17]. Продолжительность клеточного цикла составляет примерно 17,8 часа[20]. Митотический индекс может колебаться в разных корнях одного и того же растения, но усреднённые данные являются достаточно устойчивыми. Продолжительнсть митоза в разных тканях корня Allium cepa одинакова и не меняется по длине корня. Соотношение различных фаз митоза не зависит от времени фиксации.

Тесты с использованием меристематических тканей проростков корешков лука позволяют регистрировать токсические (прирост корешков), митозмодифицирующие (нарушение митотической активности меристемы, патология веретена деления) и мутагенные эффекты (индукции микроядер и хромосомные мутации)[4].

Наиболее часто применяется анализ частоты хромосомных аберраций в ана-телофазе митоза (ана-телофазный тест). В этом тесте регистрируются хромосмные мутации типа делеций и транслокаций, а также нарушения веретена деления по частоте отставания хромосом, многополюсных и асимметричных митозов. Ана-телофазный метод с использованием лука в качестве тест объекта рекомендован в качестве тест объекта природных сред. При сравнении мутагенной активности химических загрязнителей, определённых в других токсикогенетических тестах с ана-телофазным методом установлено, что чувствительность его высока и составляет 82 %.

Однако учёт только хромосмных аберраций может привести к занижению реального генотоксического эффекта, например, по следующим причинам. Во-первых, эти методы не позволяют регистрировать генные мутации, которые возникают значительно чаще хромосомных. Во вторых, хромосомные мутации выявляются, как правило на фоне высокой митотической активности меристематических клеток. Повышенная токсичность факторов среды может вызывать снижение количества делящихся клеток за счёт задержки клеточного цикла в точках контроля, либо гибели части клеток, следовательно при этом искусственно снизится и частота регистрируемых хромосомных повреждений.

Точки контроля клеточного цикла (checkpoints) представляют собой периоды цикла, где происходит проверка точности выполнения предыдущей стадии. Такой механиз предохраняет делящиеся клетки от летального митоза, останавливая деление и давая время системе репарации для восстановления повреждений ДНК. Когда контролирующий механизм обнаруживает повреждённую или не реплицированную ДНК происходит задержка в клеточном цикле, в течение которого происходит корректировка. Точками контроля являются переходы G1-S и G2-M. Существует также особая точка контроля при переходе от метафазы в анафазу. Увеличение количества нарушений при воздействии генотоксикантов приводит к задержке клеточного цикла в точках контроля, что отражается на количестве делящихся клеток и на продолжительности фаз клеточного цикла.

Как следствие, для уменьшения возможных ложноотрицательных ответов при выявлении генотоксических и канцерогенных факторов удобно использовать такой показатель как митозмодифицирующая активность изучаемого фактора, которая определяется по уровню митотической активности ткани и относительной длительности фаз митоза. Исследование митозмодифицирующей активности позволяет выявить ранние изменения цитогенетической системы организма, вызванные комплексом различных нарушений.

Митозмодифицирующий эффект в меристеме корня растений исследуется параллельно с определением частоты хромосомных аберраций. Следовательно, в одном тесте можно зарегистрировать широкий спектр нарушений генетических структур и генетических процессов, что упрощает исследование и уменьшает затраты на его проведение[21].

Таким образом использование растительной тест-системы позволяет не только сказать о количественном воздействии изучаемого факторы на живой объект, но и определить характер воздействия по поражаемым участкам генетического материала.

Для тестирования подходят факторы различной природы (см. таблицу):

Физический фактор:
  • Радиация. В 50-х Карл Сакс показал, что рентгеновские лучи способны индуцировать большое количество хромосомных мутаций в клетках кончиков корней у лука. Известны работы Гродзинского, который показал в Allium test, что уровень радиации в чернобыльской зоне отчуждения достаточен для возникновения генетических нарушений и повышенный уровень нарушений будет наблюдатся на потяжении нескольких поколений после воздействия (ионизирующее излучение)[22][23] [24]
  • Ультрафиолетовое излучение
  • Инфракрасное излучение:
    • Температура
  • Радиоизлучение (неионизирующее излучение):
    • УВЧ излучение. В частности излучение GSM диапазона сотовых телефонов. Показано, что излучение обычных сотовых телефонов (режим разговора) при длительном воздействии 1-3 часа, способно вызывать хромосомные мутации в количестве сравнимом с тем, которое вызывает 20 минутное облучение плутонием-239. Аналогичные эффекты вызывало излучение 400 и 900 Mhz создаваемое приборами-эмуляторами. Allium test рекомендован в качестве цитогенетического метода для оценки эффектов радиочастотных излучений [24] [25][26][27][28]
В случае с физическим мутагенным фактором луковицы подвергаются воздействию фактора с прочими одинаковыми условиям среды, как в контроле
Химический фактор:
  • Различные химические соединения или растворы веществ[29][30].
    • Растворы различных солей. В 1945 году Альберт Леван опубликовал статью в Nature о генотоксических эффектах солей лития, бериллия, натрия, калия, хрома, железа, кобальта, никеля, меди, мышьяка, рубидия, иттрия, палладия, кадмия, бария, лантана, неодима, эрбия, церия, золота, ртути, таллия, свинца, висьмута и тория[31]
    • Allium test был предложен для тестирования различных наночастиц. [32][33],
    • Фармацевтических и лекарственных препаратов [10][34][35]
      (например талидомида)[36]
    • Некоторых красителей [37]
    • Пестицидов [8]
  • Природных и антропогенных сред:
    • Природные воды: реки, озера [38]
    • Промышленные выбросы/сточные воды [39]
    • Шахтных вод, нарушенных экосистем в местах добычи полезных ископаемых [40]
В случае с химическим мутагенным фактором луковицы проращиваются на растворе или концентрированном растворе химического вещества и воды в заведомо определённой концентрации. Контроль проращивается на воде без добавления химического мутагенного фактора
Биологический фактор:
  • Продукты жизнедеятельности организмов
    • Биотоксины (напр. охратоксин А продуцируемый некоторыми плесневыми грибами)[41]
    • Гормоны[42][43]
    • Allium test рекомендован для биомониторинга водоемов в период "цветения" сине-зеленых водорослей [44]
Аналогично предыдущему

Методика проведения тестирования

Подготовка оборудования для тестирования

Аппаратура и материалы

чашки Петри, цилиндры мерные (25 и 100 мл), пенициллиновые флаконы или аналогичные ёмкости на 20 мл с глубоким дном, стёкла предметные и покровные, бюксы (15, 25 и 100 мл), пипетки мерные (1,0; 2,0; 10,0), пипетки глазные, лупы стереоскопические МБС-9, микроскопы[45].

Химические реактивы

Ацетоорсеин
2 %
1 г орсеина растворяют в 50 мл горячей уксусной кислоты, доводят до кипения и фильтруют. Используется для окраски корешков
Фиксатор Кларка смесь 96 % этилового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Используется для фиксации корешков.
Спирт
70 %
смесь 96 % этилового спирта и дистиллированной воды. Используется для долговременного хранения корешков
Уксусная кислота
40-45 %
смесь ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды. Используется для приготовления препаратов

Подготовка материала для тестирования

Подготовка луковиц

Выберите луковицы для исследования. Выборка должна быть однородной как в контрольном, так и в опытном вариантах опыта. Средняя масса севка — 10-20г, диаметром 1,5-2 см. Выбранные луковицы не должны быть пересушены. Это можно понять сняв лишнюю шелуху, которая так же может мешать и проведению опыта. До начала эксперимента у луковиц не должно быть проклюнувшихся зеленых ростков листьев.

Подготовка фактора мутагенеза и процедура тестирования

Существует два варианта Allium test: оригинальный и модифицированный:

  • В оригинальном варианте теста луковицы помещают для проращивания корешков в чистую воду (прим: автор допускает использование водопроводной воды. Следует взять во внимание тот факт, что в Швеции, откуда родом автор водопроводная вода действительно очень чистая. Как вариант можно использовать очищенную питьевую воду низкой минерализации). По достижении корешками 1-2 см луковицы переносят в ёмкости с исследуемым раствором на определенное время (от 2 часов в случае с раствором колхицина до 3 дней). Оригинальный вариант наиболее удобен при тестировании физических факторов.
  • В модифицированном варианте теста луковицы помещают непосредственно в исследуемый раствор без предварительного проращивания корешков. Данный вариант чаще используется при тестировании химических веществ[45].

Для чистоты эксперимента допустимо использование дистиллированной воды. При этом луковица будет расти за счёт внутренних питательных резервов на протяжении всего эксперимента не испытывая угнетенности. В экспериментах, где исследуются химически активные вещества предпочтительно использовать дистиллированную воду, чтобы избежать образования других соединений. Ограничение тут в том, что дистиллированная вода является физиологически неполноценной и в целом ряде других тестов ее использование затруднительно. Однако и в контроле, и в опыте в этом случае ущерб от дистиллированной воды будем считать равным, как и прочие фоновые условия.
Луковицы проращиваются от 3 до 4 дней. Желательно использовать ёмкости диаметром 1,5 см и высотой 10 см, чтобы по мере роста корни не упирались в дно ёмкости, в которой они находятся. Иначе это может приводить к некоторым биологическим эффектам — реакция меристемы на препятствие. Для проведения ана-телофазного анализа берут часть корешка длиной около 1 см. Проводят процедуру фиксации (для долговременного хранения). При необходимости корешки отмывают от фиксатора в воде, затем окрашивают ацеторсеином согласно стандартной методике. Для микроскопирования используют кончик корня длиной 1-2 мм — зона активного деления меристематических клеток.

Обработка материала после проведения эксперимента

Фиксация

Для фиксации корешки помещают в ёмкости с фиксатором Кларка (см.выше). Ёмкости герметично закрывают и оставляют для фиксации клеток на 1-2 дня. Затем материал промывают два раза от фиксатора в 70 % спирте, и помещают в ёмкости с 70 % спиртом для долговременного хранения. Спирт должен превосходить материал по объёму в 4-5 раз.[46][47][48]

Окрашивание материала

Окраску корешков производят 2 % ацетоорсеином (см. выше). Корешки отмывают от спирта в воде (удобно в чашках Петри). Материал переносят в небольшие фарфоровые тигли с держателем, которые на 2/3 заполняют красителем. Тигель накрывают предметным стеклом. Нагревают над пламенем спиртов до тайного кипения (запотевание покровного стекла). Тигель с материалом оставляют на некоторое время для прокрашивания хромосом (от 2 часов до 1 суток). После этого можно готовить препараты для микроскопирования.[49]

Методика приготовления препаратов для микроскопического анализа

Готовят временные давленые препараты корневых меристем. Для этого от окрашенного корешка лезвием отрезают кончик меристемы длинной 2-3 мм (кончик отличается по более темной окраске и утолщением), помещают на предметное стекло в каплю 45 % уксусной кислоты, накрывают покровным стеклом и с помощью спички аккуратно раздавливают до получения монослоя клеток. Препараты анализируют под микроскопом при увеличении 12,5х1,5х40. На препаратах рассматривают мелкие, округло-квадратной формы клетки с хорошо прокрашенными ядрами и неповрежденными клеточными стенками.[46]

Макроскопические исследования

Allium Screening test (Скринниг-тест)

Перед генетическим анализом следует провести первичный скриннинг-тест, который сразу покажет обладает ли фактор выраженной биологической активностью. Основным и наиболее важным изучаемым макропараметром является рост корней. Но помимо него могут ещё изучаться другие параметры:

  • Тургесценция. Твердость кончиков корней связана со степенью токсичности фактора. При высокой токсичности фактора тургесценция падает, что может привести к гибели корней.
  • Изменение цвета. В течение эксперимента может меняться цвет корей и причина тому — содержание в воде определенных солей (например сине-зелёный от медного купопроса). Кроме того кончики корней могут стать коричневыми, что связанно с токсическим эффектом фактора, вызывающим клеточную смерть.

В качестве стандартных исследуются следующие параметры:

  • Форма корней. Разбухание кончиков корней после 4-5 дней воздействия, свидетельствует об особом типе нарушения с-митозе. Изгиб корней или их кончиков происходит как правило после воздействия растворов определенных солей.
  • Длина корней. Это значение средней длины корней (для 1 луковицы).

Методика измерения длины корней

Измерить длину корней можно двумя способами:

  • Обычно длина корневой системы измеряется снаружи ёмкости с помощью рулетки (измерение для каждой луковицы). При это регистрируется максимальная достигнутая длина корней (не учитывая более короткие корни) для каждой луковицы. Затем вычисляется среднее по всей выборке луковиц (от 3 до 5 штук) в варианте опыта. Этот метод позволяет проводить измерения в течение эксперимента.
  • Более точным является второй способ. По окончании эксперимента корни срезаются у луковицы под основание, измеряется длина каждого корешка, вычисляется среднее значение (среднее значение для каждой луковицы). Поврежденные корни не учитываются. Затем устанавливается среднее значение длины корней для всей выборки луковиц.

Вычисление параметра корневого прироста

Можно осуществить двумя способами:

  • Рассчитывается средняя длина корней для каждой луковицы в опытных и контрольных сериях экспериментов. Затем вычисляется общее среднее значение длины для опытной серии и контрольной. Вычисляется во сколько раз длина корней в опытной серии больше/меньше чем в контрольной и выражается в процентах. Статистическую обработку результатов проводят с использованием дисперсионного анализа и/или критерия Стьюдента.
  • Можно вычислять среднее сразу в целом по каждому варианту эксперимента (т.е. не вычисляя среднего значения для конкретной луковицы, поскольку вся группа луковиц находилась в однородных условиях). Для сравнения суммарных выборок по опыту и контрольной можно использовать дисперсионный анализ и критерий Стьюдента.

Изменение длины корней в Allium test-е является показателем токсичности. Это очень чувствительный показатель, который легко регистрируется визуально и не требует никаких специальных реактивов и аппаратуры, хорошо коррелирует с микроскопическими параметрами и потому предложен в качестве краткосрочного скриннинг-теста. Если происходит значительное угнетение роста корней по сравнению с контролем, то отмечают токсический эффект воздействующего фактора. В случае значительного прироста корней, говорят о стимулирующем эффекте.

Микроскопические исследования и статистическая обработка

Два микроядра в меристеме Allium cepa, образованные ацентрическими фрагментами

Расчет частоты мутаций

В Allium test для расчета частоты мутаций традиционно применяется метод ана-телофазного анализа частоты хромосомных аберраций. На стадии ана- телофазы регистрируются мутации, связанные с грубым нарушением структуры хромосом, а также с повреждением митотического веретена (веретена деления) или изменением поведения хромосом на веретене деления[50]:

  • отставания хромосом,
  • аберрантные митозы:
    • трёхполюсные митозы,
    • четырёхполюсные митозы,
    • несимметричные (асимметричные) митозы[17].

Рекомендации

При оценке мутагенной активности химических веществ достаточно использовать лишь ана-телофазный анализ, то есть регистрировать мутации в фазах митоза, так как меристемы в течение всего опыта находятся в контакте с воздействующим фактором. Но при изучении мутагенной активности ЭМИ этого оказалось недостаточно, поскольку воздействию излучения корневые меристемы подвергаются лишь некоторый период времени. В промежутках между облучениями происходит преобразование индуцированных в анафазе и телофазе хромосомных фрагментов — клетки выходят из митоза и переходят в интерфазу, а фрагменты становятся микроядрами. В результате эти мутации остаются неучтенными. В связи с этим была предложена модификация метода Allium test, которая позволяет учитывать всю сумму мутаций. На одном препарате было рекомендовано применять ана-телофазный анализ и микроядерный тест. При этом анализируется вся совокупность клеток (делящиеся и не делящиеся), что позволяет избежать ложноотрицательных ответов и дает более достоверные результаты [26].

Расчет митотического и фазных индексов

Расчёт митотических индексов можно проводить на тех же препаратах, что и ана-телофазный анализ. Просматривается от 400 до 600 клеток (больше — лучше). Подсчитывается общее количество делящихся клеток и отдельно клетки на разных стадиях митоза.

Обозначение индекса
/ MI
MI, % — митотический (mitotic) индекс
Митотический индекс — процент делящихся клеток от общего числа проанализированных клеток.
Mi=\frac\mbox{(P+M+A+T)}\mbox{N}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а N — общее число проанализированных клеток.

П / ПИ[51]

профаза (prophase)

ПИ, % — профазный индекс
Профазный индекс — процент клеток в профазе митоза от общего числа проанализированных клеток
\mbox{Pi}=\frac\mbox{P}\mbox{(P+M+A+T)}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а P — количество профаз в просчитанных клетках

М / МИ[51]

метафаза (metaphase)

МИ, % — метафазный индекс
Метафазный индекс — процент клеток в метафазе митоза от общего числа проанализированных клеток
\mbox{Mi}=\frac\mbox{M}\mbox{(P+M+A+T)}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а M — количество метафаз в просчитанных клетках

А / АИ

анафаза (anaphase)

АИ, % — анафазный индекс
Анафазный индекс — процент клеток в анафазе митоза от общего числа проанализированных клеток
\mbox{Ai}=\frac\mbox{A}\mbox{(P+M+A+T)}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А — количество анафаз в просчитанных клетках

Т / ТИ

телофаза (telophase)

ТИ, % — телофазный индекс
Телофазный индекс — процент клеток в телофазе митоза от общего числа проанализированных клеток
\mbox{Ti}=\frac\mbox{T}\mbox{(P+M+A+T)}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а Т — количество телофаз в просчитанных клетках

А-Т / А-ТИ

ана- телофаза

А-ТИ, % — ана- телофазный индекс
Ана- телофазный индекс — процент клеток в анафазе и телофазе митоза от общего числа проанализированных клеток
\mbox{A-Ti}=\frac\mbox{(A+T)}\mbox{(P+M+A+T)}*100%


, где (P+M+A+T) — сумма клеток, находящихся на стадии профазы, метафазы, ана- и телофазы, а А+Т — количество ана- и телофаз в просчитанных клетках

Статистическая обработка данных

Статистические методы

Среднее арифметическое

Вариантным является каждый корешок. Если вариант меньше 30, следует пользоваться прямым способом: все варианты суммируются и полученная сумма делится на число вариант:

\overline X = \frac {X_1 + X_2 + X_3 + \dots}{n} = \frac {\Sigma X}{n}
, где ΣX — сумма вариант,
n — здесь и далее количество проанализированных вариантов (корешков, микроскопических препаратов).

Полученные интегральные данные о фазных индексах подвергают статистической обработке. Обработку проводят по формулам для малых выборок (см. среднее арифметическое).

Среднее квадратическое отклонение σ

Для малых выборок σ рассчитывается по формуле:

\sigma=\pm \sqrt{\frac{\Sigma(X_i-\overline X)}{(n-1)}}

Среднее квадратичное отклонение (σ) характеризуется разнообразием признаков. Оно учитывает отклонение от среднеарифметической каждой варианты. Поэтому σ является наилучшим показателем разнообразия признака.

Средняя ошибка для оценки достоверности средней арифметической

Для малых выборок:

m=\pm\frac{\sigma}{\sqrt n}

, где m — ошибка среднего,
σ — среднее квадратичное отклонение

Средние арифметические, характеризующие действие изучаемого вещества на митотическую активность клеток меристемы Allium cepa, рассчитаны для небольшого числа повторностей. Достоверность для всей генеральной совокупности устанавливается при помощи средней ошибки (m).

Величина средней ошибки находится в обратной зависимости от n. Таким образом, чем больше повторностей опыта исследуется, тем меньше ошибка X.
Величину X следует записывать с величиной его ошибки:

Обозначение Пример Вид графика
\overline X \pm m
5 ± 0,5 %
XAM
Число степеней свободы
\mathsf\nu=n-1

Нахождение показателя достоверности разницы осуществляется в несколько этапов. Вычисляется число степеней свободы.

td=\frac{\overline x_0 - \overline x_k}{S_d}

, где X0 — среднее арифметическое опытного варианта,
Xk — среднее арифметическое контрольного варианта,
Sd — ошибка отклонения, которая определяется при n1\not=n2

Далее следует сравнить рассчитанные средние арифметические значения индекса (показателя) контрольного и опытного вариантов. X двух сравниваемых групп, даже взятых из одной генеральной совокупности, всегда могут в какой-то мере отличаться друг от друга. Для чего выясняем, являются ли различия между средними арифметическими контрольного и опытных вариантов достоверными, или же это различие случайно. Для выяснения вопроса можно воспользоваться t-критерием Стьюдента.

Ошибка отклонения
при n1≠n2
S_d=\sqrt{\frac{\Sigma(x_i-\overline x_0)^2+\Sigma(x_i-\overline x_k)^2}{n_0+n_k-2}{\left (\frac{1}{n_0}+\frac{1}{n_k}\right )}}
, если n1=n2
S_d=\sqrt{(m_0^2+m_k^2)}

Более подробно в методическом пособии.[52]

\mbox{XA}, %=\frac{n}{(\mbox{A}+\mbox{T})}*100

Программно-статистические методы

Проводиться с использованием математических пакетов (Statistica, MS Excel, LibreOffice Calc и др.). Для статистического анализа данных, полученных методом Allium test (частота хромосомных аберраций и микроядер, фазных индексов и т. д.) можно использовать само вычисляющую электронную таблицу, совместимую с MS Excel или LO Calc.

В таблице есть возможность эффективно группировать данные на листе, предоставляя выходные данные в удобном для последующей обработки и использования, виде, а также в будущем наращивать функционал таблицы под специфические задачи или при расширении обсчитываемых параметров теста[53].

См. также

Источники информации

Примечания

  1. Д. С. Песня, А. В. Романовский, И. М. Прохорова, Т. К. Артѐмова, М. И. Ковалѐва, А. Н. Фомичева, Е. С. Кондакова, К. М. Халюто, С. А. Вакорин ИССЛЕДОВАНИЕ МУТАГЕННОГО ЭФФЕКТА МОДУЛИРОВАННОГО УВЧ ИЗЛУЧЕНИЯ СОТОВЫХ ТЕЛЕФОНОВ НА РАСТИТЕЛЬНЫХ И ЖИВОТНЫХ ОРГАНИЗМАХ IN VIVO (рус.). — 2010. — С. 924-929.
  2. 1 2 Арефьев В.А., Лисовенко Л.А. Англо-русский толковый словарь генетических терминов. — ВНИРО, 1995. — 407 с.
  3. 1 2 3 Fiskesjо G. The Allium Test as a standard in environmental monitoring // Hereditas. — 1985. — Т. 102. — С. 99-112.
  4. 1 2 3 Sharma C.B. Plant meristems as monitors of genetic toxicity of environmental chemicals // Current science. — 1983. — Т. 52. — № 81. — С. 1000-1002.
  5. 1 2 3 Прохорова И. М., Фомичёва П. Н., Ковалёва М. И. и др. Особенности пространственной динамики мутагенной активности воды р. Которосль и оз. Неро. // Современные проблемы биологии, экологии, хмимии : Региональный сборник научных трудов. — Ярославль, 2005. — С. 118-119.
  6. Constantin M.J., Owens E.T. Introduction and perspectives of plant genetic and cytogenetic assay // Mutat. Res.. — 1982. — С. 1-12.
  7. WHO World Health Organization monographs on selected medicinal plants // World Health Organization. — Geneva, 1999. — Т. 1.
  8. 1 2 Magda I. Soliman Genotoxicity testing of neem plant (Azadirachta indica A. Juss) using the Allium cepa chromosome aberration assay // Biological Science. — Asian Network for science information, 2001. — № 1(11). — С. 1021-1027.
  9. Cotelle S., Masfaraud J.F., Férard J.F. Assessment of the genotoxicity of contaminated soil with the Allium/Vicia-micronucleus and the Tradescantia-micronucleus assays // Mutat. Res.. — Elsevier B.V., 1999. — № 426 (2). — С. 167-71.
  10. 1 2 Abu, Ngozi E. and Mba, K. C. Mutagenecity testing of phamarceutical effluents on Allium cepa root tip meristems // Toxicology and Environmental Health Sciences. — Academic journals, 2011. — № 3(2). — С. 44-51.
  11. JOHN HENRY SCHAFFNER The nature and distribution of attraction-spheres and centrosomes in vegetable cells // Bot. Gaz. — 1894. — № 19. — С. 445-459.
  12. JOHN HENRY SCHAFFNER Karyokinesis in the root tips of Allium cepa // Bot. Gaz. — 1898. — № 26. — С. 225-238.
  13. J. Kwasniewska, G. NaŁęcz-Jawecki, A. Skrzypczak, G.A. PŁaza, M. Matejczyk An assessment of the genotoxic effects of landfill leachates using bacterial and plant tests. — Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012. — № 75. — С. 55-62.
  14. S.H. Doak, B. Manshian, G.J.S. Jenkins, N. Singh In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. — Mutation Research, 2012. — № 745. — С. 104-111.
  15. Manosij Ghosh, Maumita Bandyopadhyay, Anita Mukherjee Genotoxicity of titanium dioxide (TiO2) nanoparticles at two trophic levels:Plant and human lymphocytes // Chemosphere. — Elsevier B.V., 2010. — С. 1253-1262.
  16. International programme on chemical safety Envinromental health criteria. Nicel. — INCHEM.
  17. 1 2 3 Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 5
  18. Прохорова И.М. Растительные тест-системы для оценки мутагенов / Сост. И.М. Прохорова. — Ярославль: ЯрГУ, 1988. — 13 с.
  19. Paola Poli, Annamaria Buschini, Francesco Maria Restivo, Antonella Ficarelli, Francesca Cassoni1, Iliana Ferrero and Carlo Rossi Comet assay application in environmental monitoring: DNA damage in human leukocytes and plant cells in comparison with bacterial and yeast tests // Mutagenesis. — Oxford University Press: Oxford Journals, 1999. — № 14(6). — С. 547-556.
  20. Иванов В.Б. Клеточные основы роста растений. — Москва: Наука, 1974. — С. 231.
  21. Тарасов В. А. Принципы количественной оценки генетической опасности химических загрязнителей биосферы // Мутагены и канцерогены в окружающей среде: новые подходы к оценке риска для здоровья. — СПб, 1998. — С. 92-117.
  22. Karl Sax The Behavior of X-Ray Induced Chromosomal Aberrations in Allium Root Tip Cells // Getetics : статья. — Harvard University, 1941. — № 26(4). — С. 418-425.
  23. С. А. Мамедли, академик НАН Украины Д. М. Гродзинский Роль типа опыления в проявлении радиационно-индуцированной нестабильности генома у растений // Доповiдi Нацiональної академiї наук України. — Национальная Академия Наук Украины, 2007. — № 7. — С. 165-170.
  24. 1 2 Dmitry S. Pesnya, Anton V. Romanovsky Comparison of cytotoxic and genotoxic effects of plutonium-239 alpha particles and mobile phone GSM 900 radiation in the Allium cepa test. — Mutation Research, 2013. — С. in print.
  25. Романовский А., Песня Д., Прохорова И. Мутагенное действие мобильного телефона // перечень публикаций
  26. 1 2 Песня Д.С., Романовский А.В., Прохорова И.М. Разработка методики для оценки влияния УВЧ излучения сотовых телефонов и других приборов с ЭМИ на организмы in vivo // Ярославский педагогический вестник. — Ярославль: ЯГПУ им. К.Д. Ушинского, 2010. — Т. 3 (Естественные науки). — № 3. — С. 80-84.
  27. Песня Д.С., Романовский А.В., Прохорова И.М., Артёмова Т.К., Ковалева М.И., Фомичева А.Н., Соколов С.А., Кондакова Е.С., Шешина К.А., Вакорин С.А. Исследование биологического эффекта модулированного УВЧ излучения на растительных и животных организмах in vivo // Биомедицинские технологии и радиоэлектроника : статья. — Москва: Радиотехника, 2011. — № 4. — С. 34-45.
  28. Mirta Tkalec, Krešimir Malarić, Mirjana Pavlica, Branka Pevalek-Kozlina and Željka Vidaković-Cifrek Effects of radiofrequency electromagneti fields on seed germination and root meristematic cells of Allium cepa L. // Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. — Elsevier B.V., 2009. — № 642(2). — С. 76-81.
  29. Olorunfemi D., Iogieseri U. M., Akinboro A. Genotoxicity Screening of Industrial Effluents using Onion bulbs (Allium cepa L.) // Appl. Sci. Environ.. — JASEM, 2011. — С. 211-216.
  30. de Rainho CR, Kaezer A, Aiub CA, Felzenszwalb I. Ability of Allium cepa L. root tips and Tradescantia pallida var. purpurea in N-nitrosodiethylamine genotoxicity and mutagenicity evaluation // An. Acad.Bras. Cienc.. — 2010. — С. 925-932.
  31. ALBERT LEVAN Cytological Reactions Induced by Inorganic Salt Solutions // Nature. — London: Nature Publishing Group, 1945. — № 156. — С. 751-752.
  32. K. Klancnik, D. Drobne, J. Valant, J. Dolenc Koc Use of a modified Allium test with nanoTiO2 // Ecotoxicology and Environmental Safety. — Elsevier B.V., 2010.
  33. K. Babu, M. Deepa, S. G. Shankar & S. Rai Effect of Nano-Silver on Cell Division and Mitotic Chromosomes: A Prefatory Siren // The Internet Journal of Nanotechnology. — ISPUB, 2008.
  34. Aganović-Musinović I, Todić M, Becić F, Kusturica J. Genotoxicity evaluation of paracetamol applying Allium test // Medical Arh.. — 2004. — № 58(4). — С. 206-209??.
  35. Aşkin Celik T., Aslantürk O.S. Evaluation of cytotoxicity and genotoxicity of Inula viscosa leaf extracts with Allium test // J. Biomed. Biotechnol.. — 2010.
  36. G. GIACOMELLO, P. MALATESTA & G. QUAGLIA Action of Thalidomide on Radical Meristems of Allium cepa // Nature. — London: Nature Publishing Group, 1964. — № 201. — С. 940-941.
  37. LEOPOLD REJNIAK & HALINA PIOTROWSKA Effect of Malachite Green, Congo Red and Safranin on Cell Division in Gemmae of Allium cepa // Nature. — London: Nature Publishing Group, 1966. — № 209. — С. 517-518.
  38. Barbério A, Barros L, Voltolini JC, Mello ML. Evaluation of the cytotoxic and genotoxic potential of water from the River Paraíba do Sul, in Brazil, with the Allium cepa L. test // Braz. J. Biol.. — 2009. — № 69(3). — С. 837-842.
  39. Sandra Radić,, Draženka Stipaničev, Valerija Vujčić, Marija Marijanović Rajčić,Siniša Širac, Branka Pevalek-Kozlina The evaluation of surface and wastewater genotoxicity using the Allium cepa test // Science of the Total Environment. — Elsevier B.V., 2009. — № 408. — С. 1228-1233.
  40. Reginaldo Geremias, Tiago Bortolotto, Danilo Wilhelm-Filho, Rozangela Curi Pedrosa, Valfredo Tadeu de Fávere Efficacy assessment of acid mine drainage treatment with coal mining waste using Allium cepa L. as a bioindicator. — Ecotoxicology and Environmental Safety, 2012. — № 79. — С. 116-121.
  41. D. Lerda, M. Biagi Bistoni, P. Pelliccioni & N. Litterio Allium cepa as a biomonitor of ochratoxin A toxicity and genotoxicity // Plant biology. — 2010. — № 58(4).
  42. W.M. Howell, G.E. Keller III, J.D. Kirkpatrick, R.L. Jenkins, R.N. Hunsinger and E.W. McLaughlin Effects of the plant steroidal hormone, 24-epibrassinolide, on the mitotic index and growth of onion (Allium cepa) root tips // Genet. Mol. Res.. — Samford University: GMR, 2007. — № 6(1). — С. 50-58.
  43. M. ANNUNCIATA McMANUS Certain Mitotic Effects of Kinetin, Gibberellic Acid, Indoleacetic Acid, and Maleic Hydrazide on the Root of Allium cepa // Nature. — London: Nature Publishing Group, 1960. — № 185. — С. 44-45.
  44. Haywood Dail Laughinghouse IV, Daniel Prá, Maria Estela Silva-Stenico, Alexandre Rieger, Viviane Dal-Souto Frescura, Marli Fátima Fiore, Solange Bosio Tedesco Biomonitoring genotoxicity and cytotoxicity of Microcystis aeruginosa (Chroococcales, Cyanobacteria) using the Allium cepa test. — Science of The Total Environment, 2012. — № 432. — С. 180-188.
  45. 1 2 Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 12
  46. 1 2 Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 14-15
  47. Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 17
  48. Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 13
  49. Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 14
  50. Песня Д.С., Романовский А.В. Митоз в растительной клетке: норма и патология : Научно-практические пособие. — Москва: JRE – ИРЭ им. В.А.Котельникова РАН, 2010. — С. 929.
  51. 1 2 Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 21
  52. Прохорова И.М. и др. Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды, 2003, с. 15-21
  53. Романовский А.В., Песня Д.С., Эффективное использование электронных таблиц на примере генотоксикологических исследований проб воды // Биология внутренних вод: Материалы XIV международной школы-конференции молодых ученых. — Борок, ИБВВ им. И.Д. Папанина РАН: Принтхаус, 2010. — С. 120-127.

Литература

Статьи

Методические пособия

И.М. Прохорова, М.И. Комарова, А.Н. Фомичева Оценка митотоксического и мутагенного действия факторов окружающей среды. — Методические указания. — Ярославль: Яросл. гос. ун-т., 2003. — 32 с. — 100 экз.


Wikimedia Foundation. 2010.

Смотреть что такое "Allium test" в других словарях:

  • Allium-test — Allium test. См. Allium тест. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

  • Allium-тест — * Allium тэст * Allium test тест на кластогенность, в котором используются корешки проростков репчатого лука . Метод был разработан в 1938 г. А. Леваном. Репчатый лук относится к ряду лучших объектов при оценке генотоксичности различных факторов …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • Allium-тест — Allium test Allium тест. Pазработанный более 50 лет назад (А.Леваном в 1938) тест на кластогенность <clastogenicity>, в котором в качестве материала используются корешки проростков репчатого лука Allium cepa; в настоящее время термин А. т.… …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

  • Vicia test — Эту статью следует викифицировать. Пожалуйста, оформите её согласно правилам оформления статей …   Википедия

  • луки — Allium: A.cepa, A.sativum, A.fistulosum etc. (onion, leek, garlic) луки. Pод дву и многолетних однодольных травянистых растений из семейства лилейных, Liliaceae (или луковых, Alliaceae); известно свыше 500 видов, некоторые из которых… …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

  • Леван, Альберт — Альберт Леван Johan Albert Levan …   Википедия

  • Ана-телофазный метод анализа хромосомных аберраций — Ана телофазный анализ  генетический тест, основанный на визуальном учёте хромосомных аберраций (повреждения хромосом) на стадии анафазы и телофазы митотического цикла клетки. Ана телофазный анализ  простой, экономичный метод, который не …   Википедия

  • Лук репчатый — Общий вид растения …   Википедия

  • Приложение 1 — Животные, растения и микроорганизмы наиболее распространенные объекты генетических исследований.1 Acetabularia ацетабулярия. Pод одноклеточных зеленых водорослей класса сифоновых, характеризуются гигантским (до 2 мм в диаметре) ядром именно… …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

  • Митоз — Фазы митоза Митоз (греч …   Википедия


Поделиться ссылкой на выделенное

Прямая ссылка:
Нажмите правой клавишей мыши и выберите «Копировать ссылку»

We are using cookies for the best presentation of our site. Continuing to use this site, you agree with this.