ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

(ситовая хро-матография), жидкостная хроматография, основанная наразл. способности молекул разного размера проникать в поры неионогенного геля, к-рый служит неподвижной фазой. Различают гель-проникающую хроматографию (элюент - орг. р-ритель) и гель-фильтрацию (элюент - вода).
Ддя Э. х. используют макропористые неорг. или полимерные сорбенты. Для Э. х. полярных полимеров неорг. сорбенты (силикагели и макропористые стекла) модифицируют кремнийорг. радикалами, а для Э. х. гидрофильных полимеров -гидрофильными группами. Среди полимерных сорбентов наиб. распространены стирол-дивинилбензольные (для Э. х. высокополимеров и олигомеров). Для гель-фильтрации биополимеров, прежде всего белков, используют гидрофильные полимерные сорбенты (сефадексы - декстраны с поперечными сшивками, а также полиакриламидные гели) или модифицированные полисахаридами макропористые силикагели.
Э. х. эффективно применяют при разработке новых полимеров, технол. процессов их получения, контроле произ-ва и стандартизации полимеров. Э. х. используют для анализа ММР полимеров, исследования, выделения и очистки полимеров, в т. ч. биополимеров.
При Э. х. молекулы, имеющие в р-ре большой размер, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор сорбента (геля) и вымываются из колонки раньше, чем небольшие молекулы. Соотношение эффективных размеров макромолекул и пор сорбента определяет коэф. распределения d,> от к-рого зависит объем удерживания компонента R в колонке:

где 0 -> объем пространства между частицами сорбента, V_p - объем пор сорбента.
Эффективным размером макромолекулы при Э. х. является ее гидродинамич. радиус R, к-рый вместе с мол. массой полимера Мопределяет характеристич. вязкость полимера . Универсальную калибровочную зависимость R от произведения (ур-ние 2) впервые получил экспериментально Г. Бенуа, она имеет вид (рис. 1):

где А и В - константы. Ур-ние (2) одинаково справедливо для линейных и разветвленных полимеров, блок- и привитых сополимеров, олигомеров. Используя ур-ние Марка-Ку-на-Хувинка: где и а - табулированные константы, учитывающие взаимод. полимера с р-рителем и степень жесткости макромолекулы, можно перейти от универсальной зависимости (2) к рабочей зависимости (3) для исследуемого образца (рис. 2):

где С ₂ = B(a+1).

Рис. 1. Универсальная калибровочная зависимость Бенуа для эксклюзионной хроматографии: - линейный полистирол; - разветвленный полистирол; (+) -звездообразный полистирол;- гетеропривитой сополимер полистирола и полиметилметакрилата; - полиметилметакрилат;- разветвленный полифенилсилоксан; -полибутадиен.

С др. стороны, получив экспериментально зависимость (2) с использованием полимерных стандартов (не менее 3 образцов), для к-рых известны М, и а, а также зависимость (3) для полимера с неизвестными константами, можно найти для него , а и константы С ₁ и С ₂. Можно определять зависимость (3) и непосредственно путем калибровки узкодисперсными (с известными М)и широкодисперсными (с известным ММР) стандартами. Располагая эксклюзионной хроматограммой и калибровочной зависимостью определяют ММР исследуемого полимера.

Рис. 2. Рабочая калибровочная зависимость для эксклюзионной хроматографии.

В области от 0 до T > (объем колонки, доступный для р-рителя и молекул ниже определенного размера, соответствующего М _мин) рабочая зависимость имеет линейный (квазилинейный) характер. Соответствующие объемам 0 > и T мол. массы представляют собой пределы исключения - М _макс (молекулы большого размера, не проникают в поры сорбента) и М _мин, (молекулы небольшие, полностью проникают в поры сорбента). Эти величины, а также тангенс угла наклона линейной части калибровочной зависимости селективности разделения С ₂ = V_p/lg(M _макс/M _мин )и степень ее линейности определяют качество сорбента для Э. х. Благодаря логарифмич. зависимости Vот Мселективность разделения dV/dM падает с увеличением М, поскольку С ₂ = (dV/dM)M. > Для разделения макромолекул с близкими Мтребуется сорбент, работающий в узком диапазоне Ми обладающий высокой селективностью С ₂. Сорбенты с порами одного размера теоретически способны разделять макромолекулы в пределах коммерческие сорбенты характеризуются . Ддя разделения макромолекул в большом диапазоне Мнужны сорбенты с бимодальным и тримодальным распределением пор по размерам, обеспечивающие линейную мол.-массовую калибровочную зависимость в диапазоне М =10^2,5 - 10^6,5. Селективность С ₂ подобного сорбента (или специально подобранной смеси сорбентов) естественно ниже, чем унимодального сорбента, но ее делают максимальной для заданного диапазона Макс. селективность достигается увеличением объема перового пространства сорбента, у бимодального и тримодального сорбентов, кроме того,-оптимальным распределением пор по размерам. Важно, чтобы при разделении смеси макромолекул их наибольшая и наименьшая Мнаходились в пределах М _МИН - М _МАКС характерных для данного сорбента. Иначе по краям хроматограммы при T и V₀ будут выходить из колонки макромолекулы соотв. с М М> _МИН и М М> _МАКС, образуя ложные хроматографич. пики.

Механизм Э. х. Макромолекулы в р-ре представляют собой статистич. ансамбль (статистич. клубок). Их распределение между пористым сорбентом и р-ром контролируется изменением энергии Гиббса при переходе макромолекулы из р-ра в поры: где - изменение энтальпии макромолекулы вследствие взаимод. ее сегментов с пов-стью сорбента (матрицей геля);- уменьшение энтропии при переходе макромолекулы из р-ра в поры; Т - абс. т-ра. Разделение макромолекул происходит в эксклюзионном режиме, когда , a d,> зависящий от соотношения размеров макромолекул и пор, меньше 1.
В критич. условиях, когда при переходе макромолекул из р-ра в поры сорбента энергия Гиббса не изменяется происходит полная компенсация потери энтропии макромолекулы благодаря увеличению энтальпии: т. е. переход макромолекулы из р-ра в поры энергетически безразличен. При 0 и d1 наблюдается адсорбционная хроматография. В критич. условиях все макромолекулы, независимо от М, имеют d=>1 и, не разделяясь, выходят из колонки при R= Т В эксклюзионной области при макромолекулы с большей Мсильнее вытесняются из пор, т. к. их энтропия при переходе из р-ра в поры уменьшается в большей степени.
На рис. 3показаны кривые зависимости от энергии взаимод. сегментов макромолекулы (см. Макромолекула) с пов-стью сорбента. Эти кривые для макромолекул с разным числом сегментов (N)пересекаются в точке критич. энергии Кривые левее точки относятся к режиму Э. х. Отсюда ясно, что Э. х. включает значит. область энергетич. зависимостей где имеет значения от до Чем меньше тем больше изменение при попадании макромолекулы в поры и, следовательно, разделение макромолекулы более селективно.

Рис. 3. Зависимость и для разных 1 >N₂N₃)>.

Гетерополимеры (сополимеры, функциональные олигомеры) можно анализировать как с помощью Э. х. (когда у всех компонентов ), так и в условиях, когда у одного из компонентов В этих (критических) условиях указанный компонент представляет хроматографич. "невидимку" (его d не зависит от М). Последнее позволяет по законам Э. х. анализировать ММР отдельных блоков блок-сополимера, ММР функциональных олигомеров (отдельно для каждого типа функциональности), а вблизи критич. условий получать с помощью Э. х. ММР олигомеров для каждого типа функциональности.
У макромолекул, несущих электрич. заряд (полиэлектролитов), наблюдаются схожие, но более сильные изменения в зависимости от рН и ионной силы элюента, Это происходит благодаря увеличению размеров молекул полиэлектролитов при их диссоциации и проявлению кулоновских взаимод. между зарядами на больших расстояниях, чем в случае действия дисперсионных или электростатич. сил. При увеличении рН выше 4 пов-сть силикагелей приобретает отрицательный заряд. Взаимод. с ней нейтральной макромолекулы остается эксклюзионным (режим Э. х.), поликатион адсорбируется благодаря ионообменной сорбции, а полианион исключается из пор по законам ионной эксклюзии значительно сильнее, чем при обычной эксклюзии.
Для подавления нежелательных для Э. х. явлений ионной эксклюзии и ионообменной сорбции модифицируют пов-сть сорбентов (для придания ей нейтрального заряда при рН > 4), увеличивают ионную силу р-рителя, ослабляя кулоновские взаимод., добавляют орг. р-рители, смещая тем самым рК полиэлектролита или изоэлектрич. точку у полиамфолитов. С др. стороны, ионообменную сорбцию и ионную эксклюзию можно использовать для разделения нейтральных макромолекул, полианионов и поликатионов одного размера. Поскольку диссоциация полиэлектролитов увеличивается с разбавлением их р-ров, то при Э. х. макромолекулы на краях хроматографич. колонки, где их концентрация мала, диссоциируют и движутся по колонке не по законам Э. х., а по законам ионообменной сорбции и ионной эксклюзии в зависимости от заряда пов-сти сорбента и макромолекулы, что приводит к искажению формы кривой зависимости Vи М(рис. 4), а также позволяет диагностировать наличие того или другого процесса.

Рис. 4. Эксклюзионная хроматография нейтральных макромолекул (а) и полиэлектролитов: ионная эксклюзия (б), ионообменная сорбция ( в).

Эффекты, аналогичные ионообменной сорбции, но только в более слабой степени, могут наблюдаться при гидрофобных взаимод. макромолекулярных сегментов с модифицированной гидрофобными радикалами пов-стью сорбента или при электростатич. взаимод. поверхностных силанольных гидроксигрупп с функциональными группами полярных макромолекул. Все эти эффекты должны подавляться при проведении Э. х.

Техника Э. х. Для разделения макромолекул в режиме Э. х. используют колонки двух типов: работающие в узком = 10² и широком (= 10⁴ Ч 10⁵ диапазонах. Колонки широкого диапазона M имеют широкое распределение пор сорбента по размерам (бимодальное, тримодальное). Это распределение подбирается т. обр., чтобы при заданных степени линейности калибровочной мол.-массовой зависимости и диапазона масс обеспечивалась наиб. степень селективности С ₂.> Можно также составлять колонки для широкого диапазона Миз колонок первого типа.
Разные типы полимеров требуют спец. р-рителей для Э. х. наиб. универсальный р-ритель - ТГФ (для Э. х. полибутадиена, полистирола, полиметакрилата, полиакрилатов). ТГФ имеет низкую вязкость, однако требует очистки от пероксидов. Толуол, хлороформ и метилэтилкетон также широко используют в Э. х. полимеров. Для Э. х. полиолефинов применяют о-дихлорбензол и 1,2,4-трихлорбензол, а для полиакрилонитрила, полиэфиров и полиамидов - м-крезол, фторированные спирты и к-ты.
Калибровку колонок в диапазоне масс 5 х 10²- 1,5 х 10⁷ осуществляют с помощью стандартных узкодисперсных полистиролов. Выпускают также стандарты полиметилметакрилата, полиизопрена, полиэтилена, полиэтиленгликоля и биополимеров (декстран и др.).
Э. х. осуществляется с помощью хроматографа, детектором служит спектрофотометр или проточный рефрактометр с предельной чувствительностью 5 х 10^-8 ед. рефракции, что соответствует концентрации полимера 5-10^-5 %. Обычно прибор работает при комнатной т-ре, однако Э. х. полиолефинов требует повышенной т-ры, что способствует увеличению селективности разделения, эффективности колонок и скорости анализа вследствие уменьшения вязкости подвижной фазы. Совр. хроматографы комплектуются автоматич. устройством для приготовления (растворение полимера, фильтрация р-ра) и ввода пробы, компьютером для интерпретации результатов анализа ММР. Концентрацию пробы (с) следует уменьшать с ростом Мполимера: для полимера с М 10⁴ с = 0,25 % по массе, 3х 10⁴ - 2 х 10⁴ с= 0,1%, 4 х 10^{5 -} 2 х 10⁶ с = 0,05%, М>2 х 10⁶ с = 0,01%.
Применение комбинации рефрактометрич. детектора и детектора многоуглового рассеяния света - фотометра позволяет определять ММР и индексы разветвленности без калибровки хроматографа по полимерным стандартам.
Э. х. применяют для исследования и выделения полимеров в диапазоне М10² - 2 х 10⁷. Наилучшая селективность достигнута для олигомеров - выделяют олигомергомологи с числом звеньев до 10-15. Особенность Э. х. олигомеров состоит в том, что на хроматограмме выходят пики для каждого из олигомергомологов, присутствующих в олигомере. Поэтому можно определять ММР олигомера без калибровки колонок, если известна Модного или неск. олигомергомологов.
При гель-фильтрации белков необходимо принимать меры для предотвращения их адсорбции на сорбенте и не допускать их денатурации. В отличие от Э. х. синтетич. полимеров и олигомеров, используемой гл. обр. в аналит. целях, гель-фильтрация белков - один из важнейших способов их выделения и очистки. Разрешение белков по Мпри гель-фильтрации ниже, чем при гель-проникающей хроматографии синтетич. полимеров, т. к. для белков М >^1/3, а для гибкоцепных полимеров М >^1/2. Можно повысить чувствительность определения Мбелков методом гель-фильтрации, если проводить ее в условиях денатурации: в о М р-ре гуанидинхлорида (R ~ М^1/2) или в р-ре додецилсульфоната Na (R ~ M).
Гель-фильтрацию открыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, к-рые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул, в т. ч. белков, по мол. массе, в качестве сорбента они использовали сшитый декстрановый гель. В 1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающей хроматографии определять ММР полимеров, фракционируя их на стирол-дивинилбензольном геле.

Лит.: Беленький Б. Г., Виленчик Л. 3., Хроматография полимеров, М., 1978; Нефедов П. П., Лавренко П. Н., Транспортные методы в аналитической химии полимеров, Л., 1979; Энтелис С. Г., Евреинов В. В., Кузаев А. И., Реакционноспособные олигомеры, М., 1985; Yau W.W., Kirkland J., Bly D., Modern size-exclusion liquid chromatog, raphy, N.Y., 1979; Belenkii B.G., Vilenchik L.Z., Modem liquid chromatognphy of macromolecules, Amst., 1983.

Б. Г. Беленький.