Чувствительность микроорганизмов к химиопрепаратам

Чувствительность микроорганизмов к химиопрепаратам

св-во микроорганизмов реагировать на действие химиопрепаратов приостановкой размножения или гибелью. Каждый вид или близкая группа видов имеют характерный спектр и уровень естественной (природной) Ч. по отношению к определенному препарату или группе препаратов. В чувствительных популяциях в результате мутации, рекомбинации или иммиграции закономерно появляются особи с более узким спектром и более низким уровнем Ч., к-рые в селективных условиях среды могут стать доминирующими в популяции. Такие особи и популяции называются устойчивыми (см. Антибиотики). С научной биол.-статистической точки зрения к чувствительным относят к-ры, растущие на средах с концентрациями, не превышающими Х±2 а, и не растущие на средах, превышающих эту концентрацию. К-ры или популяции, рост к-рых не подавляется на средах с концентрацией препарата больше Х±2 с, относят к устойчивым. В химиотерапии подход к определению чувствительности-устойчивости микроорганизмов иной, поскольку возможность создания концентрации химиопрепарата в крови и др. тканях животного организма лимитируется рядом факторов, и прежде всего токсическим или др. побочным действием химиопрепарата на организм. Поэтому в качестве критерия чувствительности-устойчивости микроорганизмов к химиопрепаратам избирают их терапевтические концентрации в крови и др. биотопах животного организма. Мерой Ч. микробов в указанном случае является минимальная концентрация препарата (мкг/мл), к-рая подавляет рост микробов на питательных средах в стандартных условиях постановки опыта (МИК). Исходя из отношения между МИК и концентрацией препарата в крови при введении терапевтических доз, в клин, химиотерапии выделяют 3 категории чувствительности-устойчивости микробов (см. Методические указания, 1983, 1991). К чувствительным относят штаммы, рост к-рых подавляется концентрациями препарата, создаваемыми в с-ке крови б-ного в процессе назначения обычных терапевтических доз антибиотиков. Умеренно-устойчивыми 'считаются штаммы, подавляемые концентрациями, к-рые могут быть достигнуты при введении максимальных терапевтических доз препарата. К устойчивым предложено относить штаммы, рост к-рых не подавляется концентрациями препарата, создающимися введением максимально допустимых доз. Указанные категории предложены для испытания полуколичественным методом дисков В методиках серийных разведении возможна количественная оценка чувствительности-устойчивости (МИК), к-рая сопоставляется с рекомендуемыми терапевтическими дозами. Для получения достоверных результатов испытания на Ч.м. необходимо соблюдение ряда условий, в частности: 1) испытывают в основном чистые к-ры выделенных микробов. Смешанные к-ры из-за неодинаковых темпов роста и межвидовой конкуренции часто дают искаженные результаты; 2) из каждого материала проверяют Ч. нескольких к-р одного вида или их смесь. При системных моноэтиологичных заболеваниях и закрытых внебольничных процессах выборка может состоять из 2-3 к-р. Открытые процессы, особенно вызванные условно-патогенными микробами, требуют большей выборки - 5-10 к-р; 3) в связи с изменением состава популяции в процессе инфекции испытание на Ч.м необходимо повторять каждые 5 - 7 дней; 4) в случаях ассоциированной инфекции предпочтение отдают испытанию Ч.м. у видов и вариантов, занимающих доминирующее и субдоминирующее положение в микробиоценозах; 5) испытанию на Ч. подлежат к-ры, выделенные из первичного или вторичного микробного очага. В настоящее время для определения Ч. м. применяют 3 метода: диффузии препарата в агар из бумажных дисков (дискодиффузионный), серийных разведении в бульоне и в плотной питательной среде. Определение Ч.м. к химиопрепаратам регламентировано Методическими указаниями по применению унифицированных клинических лабораторных исследований, утвержденными приказом МЗ СССР № 250 от 13.03.75 г.; Указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с использованием дисков, изданными в марте 1983 г.; методическим руководством «Эпидемиологический надзор за лекарственной устойчивостью основных возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний и тактика антибактериальной терапии» (1991). Для определения Ч.м. необходимы стандартные заводские диски из специальной бумаги. Кустарное производство дает ненадежные результаты. Питательные среды для определения Ч.м. должны быть стандартными; обеспечивать оптимальные условия для роста микробов; не содержать ингибиторов роста и избыточного количества его стимуляторов, а также веществ, подавляющих противомикробное действие антибиотиков; иметь нейтральную или слабощелочную рН(7,0 -7,4). Для бактерий, растущих на простых питательных средах, используют бульон и 1,5 - 2% агар Хоттингера, МПБ и 1,5-2% МПА, среду АГВ. Для стрептококков и гемофильных бактерий применяют те же среды с добавлением дрожжевого гидролизата. Ч. дрожжей определяют на Сабуро средах (см.), анаэробов - в специальных средах и анаэробных условиях. При определении Ч. псевдомонад необходимо присутствие в питательной среде ионов кальция и магния. Эти ионы оказывают влияние на уровень Ч. др. микробов к ряду антибиотиков, поэтому желательно, чтобы все среды содержали ионы этих элементов. Оптимальное их содержание в средах - 50 мг/л ионов кальция и 25 мг/л ионов магния. Иссл. чистые к-ры, взятые из 5-10 колоний, выращивают 18 - 20 ч на МПА, готовят смесь плотностью в 10 ЕД оптического стандарта на физрастворе и разводят в 10 раз. Ход исследования: на поверхность плотной среды наливают 2 мл иссл. к-ры и покачиванием чашки равномерно распределяют ее по всей поверхности среды, остаток отсасывают пипеткой. Среду подсушивают 20 - 30 мин при комнатной температуре, после чего на поверхность газона стерильным пинцетом накладывают диски (не более 6 на чашку) на расстоянии 2 см. друг от друга и от краев чашки. Инкубируют в термостате 24 -48 ч при 37°С (при определении метициллина и оксациллина - при 35°С). В падающем свете, на фоне темной матовой поверхности измеряют диаметр (с учетом диаметра диска) задержки роста. Оценку результатов проводят по таблице, приведенной в упомянутой инструкции 1991 г. Диаметры зон задержки роста испытанных штаммов сравнивают с пограничными значениями в таблице и относят их к одной из 3 категорий чувствительности-устойчивости. Для сокращения объема работы ВОЗ предлагает использовать класс-диски, содержащие один из антибиотиков близкой по спектру группы. Ценным в этом плане является предложенное авторами инструкции от 1983 г. предварительное испытание Ч. м. путем прямого посева патологического материала. Для контроля точности и стандартности исследований ВОЗ рекомендует параллельно с иссл. к-рами включать в опыт тест-к-ры кишечной палочки АТСС 25292, золотистого стафилококка АТСС 25923, синегнойной бактерии АТСС 27853. Для получения количественных результатов о Ч.м. используют методы серийных разведении. метод серийного разведения препарата в бульоне основан на определении способности растворенного в питательном бульоне препарата вызывать гибель или ингибировать рост находящихся в нем микробов. Для постановки опыта необходимы основные р-ры антибиотиков в дистил. воде, бульон Хоттингера или др. питательный бульон и 18-часовая бульонная к-ра иссл. штамма с примерной плотностью в 10 м.т./мл. Ход исследования: из основных разведении препаратов готовят ряды в объеме 1 мл серийных разведении (по числу иссл. к-р), кратные 2, захватывающие все уровни чувствительности-устойчивости, причем для каждого разведения нужна отдельная пипетка. Во все разведения 1-го ряда доливают по 1 мл первой иссл. к-ры, 2-го ряда - по 1 мл второй к-ры и т.д. Концентрация препарата в результате этого уменьшается в 2 раза. Контроль содержит 1 мл к-ры каждого иссл. штамма и 1 мл бульона. Инкубируют при 37°С до следующего дня. Определяют МИК, к-рая соответствует концентрации препарата в последней пробирке с видимой задержкой роста. Если необходимо установить бактерицидное действие МБК, из нескольких пробирок с задержкой роста делают высев петлей на секторы чашки с МПА. Инкубируют до следующего дня и учитывают рост. За МБК принимают концентрацию препарата в последней пробирке, высев из к-рой не дал роста. метод серийных разведении в плотной питательной среде базируется на способности растворенного в плотной питательной среде препарата ингибировать рост нанесенных на него микробов. По сравнению с методом серийных разведении в жидкой среде более производителен, чувствителен и точен. Производительность, экономичность и надежность метода резко возрастают, если иссл. к-ры наносить специальным штампом-репликатором с 25 - 50 штифтами. Ход исследования: для опыта в бутылочках заготавливают мерное количество стерильного агара Хоттингера или МПА и 3 основные концентрации антибиотиков исходя из уровней Ч. м. В расплавленный и охлажденный до 60°С агар добавляют нужное разведение антибиотика, равное 1/10 среды (концентрация антибиотика соответственно уменьшается в 10 раз), тщательно перемешивают и разливают по чашкам, на дне к-рых заранее должны быть указаны название и концентрация антибиотика и проведена горизонтальная черта, обозначающая «верх». Посев лучше проводить штампом-репликатором. Для этого в лунки штампа пастеровской пипеткой вносят по 5 капель 3 -4-часовой бульонной к-ры, стандартизированной по стандарту мутности в 5 ЕД. Штифты штампа опускают в лунки, смачивают к-рой и легким прикосновением переносят на поверхность агара с антибиотиками (метод реплик). Для посева на каждую новую чашку штифты вновь смачивают в лунках с к-рой. Перед посевом на агар антибиотиками делают отпечаток к-р на среду без препарата (контроль). Посевы инкубируют в термостате при 37°С до следующего дня (до появления роста на контроле). Учет производят с помощью бумажных матриц: на них тушью нанесены цифры от 1 до 25 или 50 (в зависимости от штампа). При учете результатов посева дно чашки накладывают на матрицу так, чтобы линия «верх» совпадала с верхним рядом отпечатков, а зоны отпечатков - с цифрами. Удобно работать с 3 матрицами, чтобы последовательно учитывать Ч. к-ры на всех 3 концентрациях препарата. К-ра считается чувствительной, если в зоне отпечатков нет ни одной колонии. Микроорганизмы, рост к-рых подавлен всеми 3 концентрациями, рассматривают как чувствительные, 2-й и 3-й концентрациями - как среднечувствительные, 3-й - как умеренно устойчивые; микроорганизмы, растущие на всех 3 концентрациях, относят к устойчивым. При различии в уровнях устойчивости у к-р, выделенных из одного патологического материала, общую оценку устойчивости популяции делают по наиболее устойчивой к-ре. Кроме классических методов, дающих ответ относительно поздно, предложены ускоренные методы определения Ч.м., в т.ч. автоматизированные, позволяющие получить ответ через 3-10 ч от начала исследования. Достоверность их в силу ряда причин ниже классических методов, что, однако, компенсируется быстрым получением ответа.

Пограничные данные диаметра зон задержки роста и значений для интерпретации результатов испытания на Ч. м.

____________________________________________________________________________________

Антибиотики (цвет диска)         Диаметры зон (мм)                                      Диаметры зон (мм)  для среды АГВ

                                                              для среды АГВ                                                                                                                     

                                                   ___________________________________________________________________

                                                          устойчивые     умеренно      чувствительные  устойчивые   чувствительные

                                                                                   устойчивые                                  

__________________________________________________________________________________________ 

Бензилпенициллин (белый)           <20                   21-28                         >29                    >25                              <12

при испытании стафилококков

Бензилпенициллин (белый)

при испытании стафилококков       <10               11-16                          >17                              -                             -

Ампициллин (белый) при

испытании стафилококков               <20               21-28                          >29                      >0,5                           <25

при испытании грам-

бактерий и энтерококков                  <9                 10-13                         >14                      >32                            <8

Карбенициллин при 

испытании кишечной

палочки и протея (белый)          <14             15-18                      >19                    >64                        <16

при испытании

синегнойной палочки

(голубой)                                        <11             12-14                     >15                    >256                        <28

Метициллин (белый)                  <13             14-18                     >19                    >16                           <8

Оксациллин (белый)                 <15             16-19                     >20                   <4                              <2  

Цефалексин (белый)                  -                      -                           -                     >32                            <8

Цефалотин (белый)                   <14             15-18                     >19                   >32                            <8

Стрептомицин (белый)             <16             17-19                     >20                   >16                            <8

Неомицин (белый)                    <12             13-16                     >17                    -                               <10

Канамицин (белый)                     <14            15-18                     >19                   >64                           <16

Гентамицин (белый)                 <15                  -                         >16                  >16                            <4

Сизомицин (белый)                    -                     -                           -                      >16                           <4

Тетрациклин (светло-желтый) <16              17-21                    >22                  >8                              <2

Доксициклин (белый)                   -                   -                            -                    >16                            <4

Эритромицин (белый)              <17              18-21                     >22                 >8                              <0,5

Олеандомицин (белый)            <16              17-20                     >21                  -                                   -

Линкомицин (белый)                <19              20-23                    >24                  >8                               <2

Левомицетин (белый)               <15              16-18                    >19                  >32                             <8

Рифампицин (оранжевый)        <12              13-15                   >16                   >8                               <2

Фузидин (белый)                         -                      -                             -                        >16                                  <2

Полимиксин (белый)                 <11              12-14                   >15                    -                                   -

Ристомицин (белый)                 <9                 10-11                   >12                  >32                              <4

 

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)