Чистые культуры

под этим наименованием в бактериологии известны культуры микроорганизмов, содержащие один определенный вид, так что "Ч. культура чумной бациллы" означает, что данный сосуд содержит культуру чумной бациллы без примеси каких бы то ни было других организмов. Благодаря применению в бактериологии метода Ч. культур, удалось выяснить весьма многие стороны морфологии и истории развития различных микроорганизмов, а равно и их физиологических функций. До применения метода Ч. культуры относительно истории развития различных бактерий и грибков существовали самые неопределенные представления; необходимость исследовать развитие бактерий в смеси с другими весьма схожими формами бактерий приводила нередко к тому, что в цикле развития одного какого-нибудь организма вносились явления, принадлежащие к циклу другого подобного ему организма. Этим же отсутствием методов исследования низших организмов в Ч. культуре объясняется долго державшееся в науке учение о произвольном зарождении. Только со времени уяснения вопроса о необходимости стерилизации удалось получить среды, лишенные каких бы то ни было организмов и их зародышей и, стало быть, пригодные для культуры определенного организма по выбору исследователя. Но выбор организма был обставлен такими затруднениями, что не только делал невозможным самый выбор, но и не давал еще уверенности в том, что данная культура содержит действительно один вид.

Над разработкой методики культивирования микроорганизмов работало весьма много ученых, и только совокупными усилиями их удалось выработать некоторые общие приемы. Все первые исследователи микроорганизмов до Р. Коха применяли обыкновенно для культур жидкие среды, причем особым распространением пользовались различные растительные отвары. При этом способе культивирования отделение одного вида от смеси различных бактерий и грибков, попавших из воздуха в отвар, можно было произвести с помощью так называемого метода разжижения (Verdünungsmethode). Метод этот (Листер) основывается на разбавлении или разжижении исследуемой среды с бактериями таким количеством простерилизованной и, следовательно, лишенной всяких организмов воды, чтобы получить, конечно приблизительно, только на каждую каплю один зародыш бактерии. Если теперь перенести в несколько сосудов со стерилизованной средой по капле, то тогда можно ожидать, что в некоторые из сосудов попадет по несколько организмов, а в некоторые только по одному и притом именно те, которые нужны. Если эти сосуды исследовать через некоторое время, то из попавших зародышей уже разовьется целое население, наполняющее раствор, заключенный в сосуде. Конечно, все такие попытки разделить бактерии не отличаются строгой определенностью и постоянством, требуют много труда и времени. Быть уверенным, что данная культура действительно "чиста", весьма трудно, так как, если в сосуд попали зародыши двух весьма похожих друг на друга организмов, то почти нет никакой возможности убедиться в этом при помощи микроскопа. Зато если в сосудпопал действительно один зародыш, то тогда уже можно получить неограниченное число сосудов с Ч. культурой данного вида.

Более удобный прием, с начала применения которого только и стало возможным говорить о действительно Ч. культурах, был предложен Робертом Кохом, и с этого времени бактериология сделала громадные успехи, основанные на точных наблюдениях. Метод желатиновых культур заключается в том, что незначительное количество исследуемого вещества, содержащего бактерии, смешивается со стерилизованной средой, смешанной с желатином, расплавленным при температуре в 30° Ц. Затем этот желатин выливается в плоский стерилизованный сосуд (чашки Коха, Петри, влажные счетные камеры и т. п.) и там застывает тонким слоем, так что зародыши микроорганизмов, распределенные в желатине, фиксируются на тех пунктах чашки, где они будут находиться в момент застывания желатина.

Чашка для плоских культур.

По прошествии 2-3 суток из этих фиксированных зародышей начнет развиваться новое происходящее от них поколение, которое и образует вокруг каждого фиксированного зародыша колонию, состоящую, само собой разумеется, из организмов, принадлежащих только к одному единственному виду. Вследствие того, что желатин представляет твердую среду, колонии между собой не будут смешиваться и благодаря этому возможно из определенной колонии получить культуры организмов одного вида. На практике для этого пользуются прокаленной платиновой проволокой, которой захватывают часть колонии и переносят ее в сосуд со стерилизованной средой.

Прибор для изоляции культуры (анаэробов от атмосферного кислорода).

Разнообразие организмов требует для их культивирования и различных сред: попытки найти универсальную среду такого состава, чтобы в ней могли развиваться все организмы, до сих пор не увенчались успехом, да и едва ли это даже возможно. Большинство бактерий, особенно гнилостные, а также некоторые патогенные, прекрасно развиваются в жидких бульонных средах. Такой мясной бульон готовится следующим способом (Petri и Maassen): полкило свежего обезжиренного мяса, нарубленного (или наскобленного) заливают в жестяном или глиняном сосуде водой (1 литр) и затем держат, часто помешивая, сначала один час при обыкновенной температуре, а потом три часа при 60°. После этого смесь кипятится 0,5 часа и фильтруется через плоеный фильтр. Бледно-желтый фильтрат доливают до литра. Такой фильтрат, благодаря присутствию солей ортофосфорной кислоты (KH₂PO₄) дает кислую реакцию — для бактерий не пригодную, поэтому его необходимо слабо подщелочить или нейтрализовать. Для нейтрализации обыкновенно применяют двууглекислый натр (соду). После того как жидкость нейтрализована, к ней прибавляют 1% сухого пептона и 0,5% хлористого натра (поваренной соли), кипятят ¹/₄ часа, фильтруют и разливают по сосудам, которые закрывают ватными пробками и стерилизуют, нагревая в автоклаве один раз до 110-120° или трижды до 100° в Коховском стерилизаторе.

Простая колба. Колбы Эрленмейера.

В большинстве лабораторий вместо мяса применяют мясной экстракт Либиха, Цибиля в количестве 0,5— 1%. Если бульон фильтруется мутным, то его просветляют, прибавляя для этого взбитый белок или "albumen ex ovis", кипятят и фильтруют, после этой операции бульон проходит прозрачным. Для культур различных плесневых грибков служит отвар лошадиного навоза, который приготовляют таким образом: берут 1 часть лошадиного навоза и разбавляют ее 3 частями воды и ставят на 24 часа в прохладном месте; затем смесь кипятят, фильтруют (один или два раза) и, разлив по сосудам, стерилизуют. Кроме этого отвара, с той же целью могут превосходно служить отвары различных фруктов, например отвар слив, груш, винограда и т. п., которые все приготовляются одинаково: настаивают в течение 12-24 часов, кипятят и фильтруют. Для культуры дрожжей наиболее часто применяют пивную бражку, которую обыкновенно достают с пивных заводов, дрожжевую воду, которую приготовляют кипячением 0,5 кг прессованных дрожжей с 2 литрами дистиллированной воды; пока жидкость еще горячая, ее фильтруют, опять кипятят 0,5 часа и снова фильтруют. Кроме того, для различных микроорганизмов требуются специальные среды: так, для бактерий, вызывающих брожение мочевины (уробактерии, см.) — моча, которая получается стерильно или же среда из мочевины, причем такая среда подвергается дискантинуированной стерилизации в течение недели ежедневно по 2-4 часа при 56-58° Ц. или же путем фильтрации через особые так называемые Шамберленовские фильтры. Конечно, почти все подобные среды отличаются довольно неопределенным химическим составом и потому не вполне пригодны для изучения вопросов питания микроорганизмов и связанных с ними процессов. Желание не только культивировать известный организм, но и заглянуть ближе в его физиологию, вызвало появление многих сред определенного химического состава. Старейшая из этих жидкостей называется раствором Пастера и состоит из 100 грамм воды, 1 грамма виннокислого аммония, 10 грамм тростникового сахара, 0,075 грамм золы дрожжей; такая среда пригодна для культуры дрожжей и высших грибков. Вместо золы дрожжей, по предложение Адольфа Мейера, применены были те соли, которые входят в состав золы. На этом основании Кон приготовил питательный раствор, названный им "нормальной бактериальной жидкостью", следующего состава: 100 грамм воды, 0,5 грамма кислого фосфорнокислого калия, 0,05грамма трехосновной фосфорнокислой извести, 0,5 грамма кристаллической сернокислой магнезии, 1,0 грамм виннокислого аммония. Негели предложил три "нормальных раствора для бактерий", из них один следующего состава: 100 грамм воды, 0,1 грамма двуфосфорнокалиевой соли, 0,02 грамма кристаллизованной сернокислой магнезии, 0,01 грамма хлористого кальция. 1,0 грамм виннокислого аммония (см. также Ушинского среда). Для культуры плесневых грибков применяется жидкость Ролена (Raulin): 1500 грамм воды, 70 грамм тростникового сахара, 10 грамм виннокаменной кислоты, 2 грамма аммиака, 0,40 грамма фосфорной кислоты, 0,25 грамма серной кислоты, 0,03 грамма кремнекислоты, 0,40 грамма кали, 0,20 грамма магнезии, 0,04 грамма окиси цинка, 0,03 грамма окиси железа. Вследствие трудности отличать по внешнему виду один вид бактерий от других, Ч. культуры имеют значение в диагностике бактерий; так, смотря по тому, образует ли данная бактерия в бульоне муть, осадок, пленку того или другого характера, судят, конечно, только при совокупности других диагностических признаков, о принадлежности бактерии к тому или другому виду. Еще большее, чем культура в жидкой среде, в диагностике имеет значение рост микроорганизмов на твердых средах и, в частности, на желатине, т. е. на том же, собственно, бульоне, но желатинированном прибавлением известного количества желатина. Количество желатина зависит, главным образом, от той температуры, при которой культивируют данный вид. Так как цель прибавления желатина — иметь твердую при данной температуре среду, то чем температура ниже, тем количество желатина может быть меньше и наоборот:

--------------------------------------------------

| при 22° Ц.     | желатина 5%     |

|-------------------------------------------------|

| при 24° Ц.     | желатина 10 %  |

|-------------------------------------------------|

| при 24¹/₂° Ц.  | желатина 12%   |

|-------------------------------------------------|

| при 25° Ц.     | желатина 15%   |

|-------------------------------------------------|

| при 25¹/₂° Ц.  | желатина 20%   |

|-------------------------------------------------|

| при 26¹/₂° Ц.  | желатина 25%   |

--------------------------------------------------

Культивируя бактерии и дрожжи на желатине, замечено было, что при культуре известных микроорганизмов желатин разжижается (вследствие выделения особого энзима (см.), а при культуре других остается в твердом виде. Это обстоятельство позволило, в целях диагностики, разделить бактерий на две группы: разжижающие и не разжижающие желатин, группы, конечно, не филогенетические и часто, кроме этого общего признака, ничем больше не сходные между собой. Мало того, даже и этот признак у некоторых видов, со слабо выраженной способностью разжижать желатин, вполне зависит от способа приготовления желатина — от продолжительности и степени нагревания его при фильтрации и стерилизации и, ясно, что вполне зависит от концентрации и реакции среды, температуры и т. д. В микробиологии прибегают к желатинированию сред самого разнообразного состава: бульон, различные растительные отвары, пивное и виноградное сусло и т. п. Другая твердая среда, тоже получившая широкое применение в бактериологии, это агар-агар, впервые примененный г-жой Hesse(по Hueppe) и представляющий различные виды красных водорослей из родов Gigartina, Gracillaria и Gelidium. Агар-агар, прибавленный к жидкой среде, делает ее твердой подобно желатину, но отличается от нее более высокой точкой плавления (выше 40° Ц.) и неспособностью разжижаться от выделяемых бактериями энзим (в последнее время были найдены, однако, некоторые бактерии, способные его разжижать). Приготовление как желатины, так еще больше агар-агара связано с целым рядом технических затруднений, зависящих от крайне медленной фильтрации этих сред, почему в бактериологической технике и отводится довольно много места описанию различных приемов при приготовлении этих твердых сред. Кроме названных сред, применяются еще для культивирования бактерий: картофель, морковь и др. овощи. Для приготовления сред из картофеля пользуются особыми пробирками или же теми же чашечками Петри, которые применяются при разливках.

Пробирка для культуры картофеля.

Для приготовления же самого картофеля пользуются двумя способами: один из этих способов состоит в том, что картофель тщательно очищают снаружи от земли, моют, обмывают раствором сулемы, иногда стерилизуют в паре и потом стерилизованным ножом делают из него кружки, которые и помещают в стерилизованные чашки Петри. Другой способ состоит в том, что из тщательно вымытого картофеля приготовляют кружки или особые косо срезанные цилиндры, помещают их в чашки Петри или особые пробирки и тогда стерилизуют. Второй способ, во всяком случае, гарантирует большую чистоту культуры. Для бактерий молока приходится применять в качестве среды молоко, но, к сожалению, до сих пор еще не выработано таких методов стерилизации, которые бы, обеспложивая молоко, не влияли бы на его состав. Само по себе молоко стерильно, если получено от здоровой коровы (и такое молоко наиболее пригодно для культур), но уже при доении в него попадает такое количество микроорганизмов из воздуха, что оно делается негодным для культур. Путем фильтрации через фильтр Шамберлена нельзя получить стерильное молоко, так как фильтр вместе с бактериями задерживает казеин и жир, пропуская только сыворотку. Различные предложенные химические способы, состоящие в прибавлении различных дезинфицирующих веществ (формалина, хлороформа и т. п.), тоже малопригодны. Остается стерилизация путем нагревания молока до 100° в течение 3 дней по 1 часу или один раз до 120° Ц., но при этом изменяется его состав: молочный сахар превращается в карамель и молоко получает желтоватую окраску, так что делается малопригодным для бактериологических целей. Те же трудности, что при приготовлении сред из молока, приходится испытывать и при приготовлении сред из мочевины и др. веществ, изменяющихся легко при нагревании. Так как изучение некоторых процессов, совершающихся в природе, например процесса нитрификации, требовало получения возбудителей этого брожения в Ч. культурах, которые, несмотря на целый ряд попыток, предпринятых различными учеными, не увенчались успехом, то вполне понятен тот интерес и значение, которое имела введенная Виноградским в бактериологическую технику чисто минеральная твердая среда, где роль желатина или агар-агара играла кремнекислота (предложенная Кюне), а самая среда имела следующий состав: сернокислого аммония 0,4, сернокислой магнезии 0,05, фосфорнокислого калия 0,1, хлористого кальция следы, углекислого натра 0,6-0,9, воды 100. Вместе с введением в бактериологическую технику кремнекислой твердой среды Виноградский ввел в бактериологию понятие об элективной культуре, дающей возможность получать в Ч. культурах микроорганизмы, не прибегая к желатину или агар-агару, но создавая в жидких культурах такие условия, при которых может обнаружиться только одна определенная функция. Так что микроорганизм, обладающий этой определенной функцией, получает возможность развиваться в более благоприятных условиях, по сравнению с другими находящимися в смеси микроорганизмами, которых развитие или замедляется, или же совершенно останавливается. Метод этот успел уже оказать большие успехи в бактериологии. Существование организмов, развитие которых происходит только в отсутствии кислорода воздуха (анаэробов), заставило позаботиться о выработке специальных методов, которые, главным образом, основаны на культуре подобных организмов в атмосфере, состоящей из индифферентного газа, как, например, азота иливодорода, или же прибегая к культурам в особых сосудах (например, приборы Бухнера, Омелянского и др.), в которых кислород атмосферы поглощается пирогаловой кислотой.

Прибор Бухнера.

После грибков и бактерий получены были в Ч. культурах водоросли (Бейеринк), для культивирования которых оказалось возможным прибегнуть к минеральным соединениям и выщелоченному агар-агару, т. е. приготовить среду, в которой количество органического материала, могущего служить пищей бактериям, было доведено до возможного minimum'a. В разливках на такой среде (почти путем элективной культуры) и были получены Ч. культуры зеленых водорослей, что сразу позволило подойти к решению некоторых физиологических и морфологических вопросов. Получение других низших организмов (амёб, слизистых грибков) в Ч. культурах оказалось невозможным, так как для успешного их развития необходимо присутствие бактерий, которые для некоторых видов амёб непосредственно служат пищей, для других необходимы косвенно, так как вызывают такие изменения в среде, которые благоприятствуют развитию амёб, оказывая даже благоприятное влияние на цикл развития некоторых организмов (Dictiostelium mucoroides, Надсон).

Все работы с Ч. культурами, т. е. пересевы микроорганизмов из одного сосуда в другой, открывание сосудов для получения пробы, необходимой для исследования — все это требует целого ряда предосторожностей, которые гарантировали бы против занесения зародышей микроорганизмов, носящихся повсюду в воздухе, в сосуды с Ч. культурой. К числу таких предохранительных мер служат особые так называемые стеклянные ящики Ганзена, в которых не только воздух, но и стенки могут быть почти совершенно лишены зародышей (опрыскиванием раствором сулемы или распылением воды со спиртом). В таких ящиках открывание сосудов сопряжено с гораздо меньшей опасностью загрязнить культуру. Помимо подобных предосторожностей, для пересева служат особые платиновые иглы, которые предварительно прокаливают, а горлышко и пробки (ватные) сосудов обжигают, чтобы убить те зародыши, которые попали из воздуха на вату. Все такие предосторожности уменьшают значительно число шансов внести в Ч. культуру споры постороннего организма.

Литература. Lister, "Transact. of the Pathol. Soc. of London" (1878); Pasteur, "Ann. de chimie et de phys." (3 сер., т. 58, 1860); Petri und Maassen, "Arbeiten aus dem Kais. Gesundheits." (VIII, № 2); Brefeld, "Botanische Untersuchungen üb. Schimmelpilze" ("Ber. d. med.-phys. Ges. zu Würzburg", 1874); Raulin, "Ann. des. sciences naturelles" (1870); Hueppe, "Die Methoden der Bakterien forschung" (1891); Winogradsky, "Ann. de l'Inst. Pasteur" (1891); Uschinsky, "Centr. für Bakt." (1894, стр. 316); Roux, "Ann. de l'Inst. Pasteur" (1888); Kühne, "Zeitschr. f. Biologie" (XXVII, Neue Folge, т. IX. 1890, тетр. 1); Petri, "Centr. für Bakt." (1887); Hansen, "Compt. rend. des trav. du lab. de Carlsberg" (II, 1886); E. Koch, "Mitt. aus dem K. Gesundheitsamte" (т. I, 1881); "Deutsche Medicinal-Zeitung" (1884); Beiyerinck, "Bot. Zeit." (1890); "Centr. für Bakt." (1896); Артари, "Известия Императорского Московского Технического Училища" (1903); Надсон, "Ботанические Записки Спб. Университета" (XV); Duclaux, "Traité de Microbiologie"; Migula, "System der Bakterien" (1897); Jörgensen, "Die Mikroogranismen der Gärungsindustrie" (1898); Klöcker, "Die Gärungsorganismen" (1900); Günther, "Einführung in das Studium der Bakteriologie".

Б. Исаченко.