ИФА

Тест система для ИФА 96 ячеек.

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов и антител.

В основе метода иммуноферментного анализа (ИФА) лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием так называемого конъюгата,который представляет собой анти-антитело,соединённое с ферментной меткой.

Конъюгат может быть получен с использованием поликлональных антивидовых антител (например, кроличьи антитела против иммуноглобулинов человека) или моноклональных антител, направленных против человеческих иммуноглобулинов определённого класса (M, G, А).

В зависимости от того, какие антитела использованы, тест-система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса (например, только иммуноглобулин G или только иммуноглобулин M).

Существует несколько методов постановки реакции, однако, в настоящее время, наиболее часто для выявления специфических антител используются следующая схема:

На лунках тест-планшета зафиксирован антиген возбудителя, который инкубируется с испытуемой сывороткой или плазмой крови. При наличии в них специфических антител происходит связывание их с образованием комплекса антиген-антитело.

В дальнейшем, при инкубации этого комплекса с конъюгатом, происходит присоединение анти-антител к имеющимся комплексам антиген-антитело. Ферментативная реакция (цветная реакция)проходит в присутствии перекиси водорода на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител.

Результат оценивается спектрофотометрически или визуально. По такому принципу построена большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Однако следует отметить, что иммуноферментный анализ может давать и ложные результаты. Ложноположительные могут возникнуть за счет ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорожденных такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Ложноотрицательные результаты реакции обусловлены конкуренцией между иммуноглобулинами М и G, а также техническими ошибками при постановке реакции.

В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на:

1. Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);
2. Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определенных белковых антигенов возбудителя;
3. Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы высокоиммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам в достаточно большом количестве) и высокоспецифичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и не дающими перекрёстных реакций с антителами другой природы).

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100%-ной специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.