Кальпонин

Кальпони́н (англ. Calponin) — входит в семейство актин-связывающих белков, типичные в основном для гладкомышечных клеток, связывающие G- и F-актин. Кальпонины являются продуктом 3 генов и подразделяются на так называемые α-кальпонин (h1 или основная, 292 а.к., 34кДа), β-кальпонин (252 а.к.) — являющийся продуктом одного и того же гена, что и α-кальпонин, но имеющая делецию аминокислот в позиции 216—256. Два других гена, кодирующие нейтральный кальпонин (h2 кальпонин) и кислый кальпонин экспрессируются на более низких уровнях гладких мышц и немышечных клеток. Другие более широко выраженные представители кальпонинов включают SM22, и трансгелин. Кальпонин иронически получил свое название от CH или Calponin Homology domain (Кальпонин-гомологичный домен), представленный во многих ABPs (Actin-binding proteins), несмотря на тот факт, что кальпонин не показывает связывание актина через этот участок (Gimona and Mital, 1998), но вместо этого связывает липиды (Bogatcheva and Busev, 1995; Fujii et al., 1995). Основа актин-связывающего сайта, как полагается, (Mezgueldi et al., 1992) имеет место в участке между CH доменом и кальпониновыми повторами. Кальпонин является термостабильным, основным белком в гладкой мышце, где он представлен как 34кДа разновидности. В других тканях представлены более кислые изоформы (кислый CaP), являющиеся кальций-независимыми, но связывают кальмодулин в чувствительной манере. Связывание Ca/кальмодулина ингибирует присоединение актина. Фосфорилирование также ингибирует связывание актина. Кальпонин имеет также тропомиозин-связывающий сайт. Кальпонин связывает много других белков, большинство из которых также являются ABPs вдобавок к фосфолипидам (Bogatcheva and Busev, 1995).

Структура кальпонина

Структура CH домена Кальпонина 1 человека (N-терминальный участок — синий, С-терминальный участок — красный)

Свойства

Кальпонин является актин-, кальмодулин-, и тропомиозин-связывающим белком, который был обнаружен в гладкомышечных тканях нескольких позвоночных и в некоторых немышечных клетках. В ходе препарирований натуральных тонких нитей куриного желудка было показано, что они содержат актин, тропомиозин, кальдесмон, и кальпонин в молярном соотношении приблизительно 7:0.9:0.6:0.7, тем самым поддерживая раннее предположение, что белок — это подлинно неотьемлемая составляющая гладкомышечных тонких нитей. Подобно кальдесмону, кальпонин, как обнаружилось, ингибирует активность актомиозиновой АТФазы в растворе, так же как скольжение актина над фосфорилированным миозином in vitro, в отсутствие и присутствии тропомиозина, и это ингибирование запускается Ca2±кальмодулином. Это подавляющее действие ликвидируется фосфорилированием белка in vitro, которое могло бы модулироваться его связыванием к Ca2±кальмодулину. Эти общие свойства приводят к предположению, что кальпонин может быть дополнительным регулирующим актин-связывающим белком, на уровне тонких филаментов, актин-миозиновых взаимодействий. Однако, его фактическую роль в клетке и локализацию по тонким филаментам еще предстоит уточнить.

Переваривание кальпонина

Полное или частичное химотриптическое переваривание кальпонина (1 мг/мл) осуществляется при 25°С, используя весовое отношение протеазы к субстрату 1:100 или 1:1000, соответственно, в 10 мМ имидазол-HCl, 30 мМ NaCl, 2 mM MgCl2, 4 мМ NaN3, pH 7.0, в отсутствии или в присутствии F-актина (4 мг/мл) (молярное соотношение актин/кальпонин = 3:1). При нужных интервалах времени (0-60 мин), вполне определенные количества белков смешиваются с равным объёмом кипящего буфера образцов Laemmli и подготовляются для гель электрофореза. Для реакций сшивания и экспериментов связывания, переваривание прекращается с 2.5 мМ фенилметилсульфонил флуоридом (PMSF). Общий гидролиз ковалентного комплекса кальпонин-актин (11 мг/мл) с CNBr (67 мг/мл, добавленный в двух равных количествах) проводится в течение 24 часов в 70 % муравьиная кислота-содержащем 14 мМ β-меркаптоэтаноле.

Показаны участки расщепления пептидных связей

Реакции сшивания

Кальпонин (0.7-1.3 мг/мл) в 10 мМ имидазол-HCl, 30 мМ NaCl, 2мМ MgCl2, 4мМ NaN3, pH 7.0, смешивается с нативным или субтилизин-расщепленным F-актином (2.4-4.5 мг/мл)(кальпонин/актин молярное соотношение = 1:3) в присутствии 2 мМ EDC и 5 мМ NHS. Реакция проводилась при 25оС в течение 0-30 мин и контролируется SDS-гель электрофорезом. Кальдесмон (1.4 мг/мл) сшивается с F-актином при одинаковых условиях с использованием белкового молярного отношения = 1:6. Ковалентная связь между F-актином и 22 кДа NH2-терминальным химотриптическим фрагментом кальпонина получается следующим образом: 60 минутное химотриптическое переваривание кальпонина, при весовом соотношении фермента к субстрату 1:1000, дополняется с F-актином при молярном соотношении 1:3, после центрифугирования при 180,000 х g в течение 1 часа при 4оС, осадок ресуспензируется в имидазол-HCl, pH 7.0, буфере. Для препаративного разделения 76 кДа F-актин-кальпонинового аддукта от несшитого кальпонина, раствор сшитого F-актин-кальпонина (110 мг белка), полученного после 45 мин реакции, доводится в 3 мМ β-меркаптоэтаноле, диализированный в течение ночи при 4оС относительно деполимеризующего буфера (50 мМ Трис-HCl, 0.6 м КI, 5 мМ тиосульфат натрия, 0.5 мМ АТФ, 0.5 мМ CaCl2, и 0.5 мМ β-меркаптоэтанол, рН 7.5), а затем гель-фильтруется через колонку Sephacryl-S-300 (1.6 х 120 см), уравновешивая при 4оС в том же буфере. Начальные белковые фракции эльюируются содержащий 76 кДа аддуктом лишенный свободного кальпонина, как и анализируется гель-электрофорезом. Объединенные фракции подвергаются диализу дистиллированной водой, лиофилизируют, и подвергают CNBr расщеплению.

См. также

• Актин
• Миозин

Ссылки

• The Calponin Family
• Mapping of the Functional Domains in the Amino-terminal Region of Calponin

Для улучшения этой статьи желательно?: Проставить для статьи более точные категории. Проставить интервики в рамках проекта Интервики.

Связать^?

На эту статью не ссылаются другие статьи Википедии. Пожалуйста, воспользуйтесь подсказкой и установите ссылки в соответствии с принятыми рекомендациями.