- хемотаксис
- хемотаксис
движение подвижных организмов под влиянием одностороннего раздражения хим. веществами. См. также таксис.(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)Хемотаксиснаправленное движение бактерий, клеток крови или др. клеток по градиенту концентрации некоторых эндогенных и экзогенных веществ (см. Хемоаттрактанты). Хемотаксическую активность лейкоцитов и хемоаттрактантную активность крови и др. нормальных и патологических жидкостей организма используют для оценки состояния иммунной системы организма, т. к. наличие и сила хемотаксического стимула, а также способность мононуклеаров и полиморфноядерных лейкоцитов (ПЯЛ) к активному передвижению и накоплению в очаге поражения в большой степени обусловливают скорость развития, интенсивность и исход воспалительного процесса. Для определения X. лейкоцитов предложено несколько методик. Чаще применяют описанный ниже метод Бойдена, основанный на способности лейкоцитов проходить через пористую мембрану в напр.авлении градиента концентрации хемоаттрактанта. Мембрана делит специальную камеру на 2 отсека: в верхний помещают взвесь лейкоцитов, в нижний - хемоаттрактант. Размер пор мембраны подбирают таким образом, чтобы лейкоциты могли проникать через них только в случае активной миграции. Суспензию ПЯЛ готовят смешиванием равных объемов опытных образцов гепаринизированной венозной крови и р-ра Хенкса и 6 -8 мл смеси наслаивают на 3 мл градиента плотности фиколл-верографина. Центрифугируют при 1500 об/мин 45 мин. Слой плазмы, интерфазу, градиент удаляют до уровня 1 -2 мм над осадком, содержащим эритроциты и ПЯЛ. Для освобождения ПЯЛ от эритроцитов добавляют подогретый до 37°С р-р полиглюкина в соотношении 70 мл на 100 мл осадка и смесь выдерживают при 37°С 60 мин в наклонном положении, после чего образовавшийся надосадок отсасывают в силиконированные центрифужные пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант сливают, к осадку доливают 0,81% р-р аммония хлорида на трис-МаС1-буфере для лизиса примеси эритроцитов, ресуспендируют, выдерживают 5 мин при комнатной температуре и вновь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин. Осадок однократно отмывают в р-ре Хенкса (рН 7,2 - 7,4) при том же режиме и готовят суспензию в р-ре Хенкса с 10% инактивированной эмбриональной с-ки телят. В камере Горяева окраской 0,1% р-ром трипанового синего устанавливают жизнеспособность клеток и находят их количество в 1 мл суспензии: число клеток в 5 больших квадратах по диагонали умножают на коэффициент 12,5 и на 10. Хранить готовую суспензию можно не более 4 ч при комнатной температуре. Для постановки реакции хемотаксиса концентрацию ПЯЛ доводят до 2x106 кл./мл Нижние 5 отсеков камеры Бойдена заполняют стандартным хемоаттрактантом, закрывают сверху предварительно смоченным в горячей дистил. воде мембранным фильтром, не оставляя пузырьков воздуха. Собирают камеру и те же 5 верхних отсеков заполняют клеточной суспензией. Параллельно (в одной камере на одном фильтре) ставят контроль: нижние отсеки заполняют культуральной средой для клеток - р-ром Хенкса с 10% инактивированной эмбриональной с-ки телят. Чтобы избежать испарения воды, камеру прикрывают стеклом и инкубируют при 37°С в течение 1 ч. После инкубации отсасывают жидкость из верхних отсеков камеры, извлекают фильтр и фиксируют его 3 мин в разведенном метаноле или 96% этаноле. Промывают дистил. водой, затем окрашивают 1% р-ром трипанового синего или по Романовскому -Гимзе. Вновь промывают дистил. водой и микроскопируют во влажном состоянии, прикрыв покровным стеклом. Количественная оценка реакции заключается в подсчете клеток в 10 полях зрения нижней стороны фильтра в опыте и контроле при увеличении микроскопа в 280 раз. Хемотаксический индекс вычисляют по формуле: ХИ = (О-К)/К x l00, где О- число клеток в 10 полях зрения, мигрировавших через, фильтр в ответ на хемоаттрактант; К - число клеток в 10 полях зрения, мигрировавших через фильтр в ответ на культуральную среду (спонтанная миграция). Определение хемоаттрактантной активности с-ки крови и секретов слизистых оболочек. В качестве индикаторных клеток используют ПЯЛ периферической крови здоровых доноров. Их получают по описанной выше методике. После выделения ПЯЛ смешивают образцы 3 - 5 доноров, устанавливают их жизнеспособность и концентрацию суспензии ПЯЛ доводят до 2 х106кл./мл. Нижние отсеки камеры заполняют иссл. жидкостями, верхние- суспензией стандартных ПЯЛ. Дальнейшую работу и учет результатов проводят по описанной выше методике. Воспроизводимость методики Бойдена зависит от ряда факторов. Решающее значение имеет выбор мембранных фильтров. Разброс результатов уменьшится, если всю серию опытов ставить на мембранах из одной и той же партии. Далее, в связи с тем что число мигрирующих клеток пропорционально их концентрации в исходной взвеси, эта концентрация должна быть постоянной от опыта к опыту. Соблюдение этого условия гарантирует ошибку метода не более 5%. X. клеток крови определяют также в агарозе.(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
.
